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褪黑素（Melatonin,MLT）是一种主要由松果体合成分泌的吲哚化合物,除松果体外还在视网膜、胃十二指肠、皮肤、骨髓和淋巴细胞中发现MLT的合成。内源性MLT在生物钟系统中扮演着重要角色,其昼谷夜峰的节律性分泌是生物钟的输出信号,通过血液循环向机体传递了昼夜节律和季节变化的信息。此外MLT还具有抗氧化和免疫调节功能,但在胃癌发生发展过程中的合成分泌、分布、昼夜节律以及对肿瘤微环境中巨噬细胞的影响尚未明确。本研究旨在建立荷胃癌小鼠模型和对MLT敏感稳定的检测方法,运用流式细胞术、LC/MS/MS、HE染色等技术手段,探讨在胃癌发生发展过程中MLT在不同器官的浓度分布、昼夜节律以及对胃癌组织微环境中M1、M2型巨噬细胞的影响。方法1.建立测定小鼠不同生物样品中MLT浓度的LC/MS/MS法。2.运用石蜡切片HE染色方法观察荷胃癌小鼠肿瘤组织的病理改变。3.运用LC/MS/MS法检测正常小鼠和荷胃癌小鼠一天内不同时间下血清和各器官中内源性MLT的波动,包括松果体、胸腺、脾脏、胃十二指肠、肝脏,以期明确正常小鼠和荷胃癌小鼠内源性MLT在不同器官的浓度分布和昼夜节律。4.运用LC/MS/MS法检测小鼠胃癌移植瘤生成后,一天内不同时间下各器官中内源性MLT浓度,包括松果体、胸腺、脾脏、胃十二指肠、肝脏,以期明确在胃癌发生发展过程中内源性MLT的浓度是否发生改变。5.运用LC/MS/MS法检测荷胃癌小鼠注射MLT不同时间后各器官中褪黑素浓度,包括胸腺、脾脏,胃十二指肠、肝脏、瘤体,以期明确肿瘤生成后外源性褪黑素在不同器官中的浓度分布。6.从肿瘤微环境角度出发,应用流式细胞技术分析肿瘤组织中M1型、M2型巨噬细胞比例,明确MLT干预后对荷胃癌小鼠胃癌组织中M1型、M2型巨噬细胞的影响。结果1.建立了不同生物样品中MLT浓度的LC/MS/MS检测方法,MLT标准品在4-1000 pg/ml范围内线性良好,回归方程:y=15.59x+7.25（r=0.9967）,在3.26-3.28 min时可见明显出峰,分子量为233.1,符合MLT的分子量,分离效果良好,周围杂峰信号小,无杂质干扰,小鼠生物样品中MLT峰保留时间适中(t R=3 min),最低检测浓度为4 pg/ml。2.HE染色结果显示:移植瘤内有大量深染巨核细胞,肿瘤细胞弥散性分布,体积大,形态不规则,细胞核异型明显,肿瘤组织血管丰富,坏死区分界明显。3.LC/MS/MS结果显示:615小鼠可以合成分泌MLT并具有昼夜节律性。松果体中MLT浓度在白天（6:00-18:00）相对较低,夜间（22:00）达到高峰,最低浓度出现在10:00;胃十二指肠中MLT浓度在夜间（22:00-6:00）相对较低,白天（10:00、18:00）达到高峰,最低浓度出现在14:00;脾脏中MLT浓度在夜间（22:00-6:00）相对较低,白天（10:00、18:00）达到高峰,最低浓度出现在2:00;胸腺中MLT浓度在夜间（18:00-2:00）相对较低,白天（10:00）达到高峰,最低浓度出现在14:00;肝脏中MLT浓度在夜间（18:00-2:00）相对较高,白天（10:00）和夜间（2:00）达到高峰,最低浓度出现在6:00;血清中MLT浓度在18:00达到高峰,最低浓度出现在14:00,其余时间MLT浓度波动较平稳。4.LC/MS/MS结果显示:荷胃癌小鼠可以合成分泌MLT并具有昼夜节律性。松果体中MLT浓度在白天（6:00-14:00）相对较低,夜间（22:00）达到高峰,最低浓度出现在14:00;胃十二指肠中MLT浓度在夜间（22:00-2:00）相对较低,白天（10:00）达到高峰,最低浓度出现在2:00;脾脏中MLT浓度在14:00-6:00相对较低,白天（10:00）达到高峰,最低浓度出现在2:00;胸腺中MLT浓度在夜间（22:00-2:00）相对较低,白天（14:00）达到高峰,最低浓度出现在22:00;肝脏中MLT浓度在夜间（22:00-2:00）相对较低,白天（6:00）达到高峰,14:00出现第二个高峰,最低浓度出现在2:00;血清中MLT浓度在18:00达到高峰,最低浓度出现在14:00,其余时间MLT浓度波动幅度较大。5.LC/MS/MS结果显示:正常小鼠胸腺中MLT浓度整体水平相对较高,除14:00和18:00外,其余时间胸腺中MLT浓度均明显高于其他器官,荷胃癌小鼠胸腺中MLT浓度较其他器官更高,在任何时间胸腺中MLT浓度均高于其他器官;正常小鼠和荷胃癌小鼠脾脏与胃十二指肠中MLT浓度相对较低,其中正常小鼠脾脏和胃十二指肠中MLT除2:00和6:00浓度较接近外,其余时间脾脏中MLT浓度均高于胃十二指肠,荷胃癌小鼠脾脏中MLT浓度在10:00与胸腺中MLT浓度相近,除14:00和18:00外,其余时间脾脏中MLT浓度均高于胃十二指肠;正常小鼠与荷胃癌小鼠相同,肝脏中MLT浓度在任何时间下均处于最低水平。6.LC/MS/MS结果显示:荷胃癌小鼠较正常小鼠在血清、松果体、胸腺、脾脏、胃十二指肠、肝脏中MLT浓度升高。其中松果体中MLT浓度在6:00、10:00、18:00、22:00、2:00较正常小鼠升高;血清中MLT浓度在6:00、10:00、18:00、22:00、2:00较正常小鼠升高;胸腺中MLT浓度在6:00、14:00、18:00、2:00较正常小鼠升高;脾脏中MLT浓度在6:00、10:00较正常小鼠升高;肝脏中MLT浓度在6:00、14:00、18:00、2:00较正常小鼠升高;胃十二指肠中MLT浓度在6:00、14:00、2:00较正常小鼠升高。7.LC/MS/MS结果显示:荷胃癌小鼠注射MLT 15 min后各器官中MLT浓度由高到低依次为肿瘤组织、脾脏、肝脏、胃十二指肠、胸腺;1 h后各器官中MLT浓度由高到低依次为胃十二指肠、胸腺、肿瘤组织、肝脏、脾脏;4 h后各器官中MLT浓度由高到低依次为胸腺、肿瘤组织、脾脏、胃十二指肠肝脏。8.流式细胞术结果显示:MLT干预一周后,与对照组相比,M1型巨噬细胞有明显下调趋势,M2型巨噬细胞无明显改变。结论1.建立了不同生物样品中褪黑素浓度的LC/MS/MS检测方法,该方法准确、可靠、稳定、灵敏度高、重复性强,适用于生物样品中褪黑素浓度的检测。2.615小鼠胸腺、脾脏、胃十二指肠、肝脏中褪黑素呈现与松果体和血液不同的具有自身特点的昼夜节律性波动。3.胃癌移植瘤生成后,松果体、胸腺、脾脏、胃十二指肠、肝脏及血液中褪黑素浓度升高,其中松果体、脾脏和血液中褪黑素的昼夜节律未发生明显改变,胃十二指肠、肝脏中褪黑素的昼夜节律发生改变,胸腺中褪黑素最高值和最低值出现时间发生推移。4.外源性褪黑素作用于荷胃癌小鼠后,胸腺和肿瘤组织中褪黑素浓度相对较高,对肿瘤组织中M1型巨噬细胞有明显下调趋势,对M2型巨噬细胞无明显影响。