氧化损伤在神经变性疾病中发挥着重要的作用。星形胶质细胞的作用涉及支持神经元的存活和保护神经元。星形胶质细胞中抗氧化能力的缺陷和许多神经变性疾病有关,例如肌萎缩侧索硬化,脊髓肌肉萎缩。脊髓中星形胶质细胞的功能损伤导致神经元的丢失。活化星形胶质细胞的抗氧化功能是治疗神经变性疾病的有效措施。Nrf2是调控Ⅱ相解毒酶的主要调控因子。TAR DNA-绑定蛋白-43(TDP-43)被认为是伴有泛素阳性包涵体的额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化(ALS)的病理性蛋白。病理性的TDP-43异常泛素化,产生C-末端片段(CTFs)并且从生理状态下的核内分布混杂入胞浆的不可溶性聚集体中。C-末端片段对神经元产生毒性并通过获得性的毒性作用诱导细胞死亡。自噬通路被认为主要是一种非选择性的自我消化过程。最近的研究表明存在一种特殊形式的自噬被称为质量控制性自噬(QC autophagy)通过泛素化结合的形式选择性地处理异常蛋白和损伤的细胞器。有研究报道细胞核内TDP-43的缺失损伤轴突的生长。成年后的中枢神经系统轴突再生能力非常有限。这和损伤后许多抑制轴突生长的抑制性因子产生的不利于轴突生长的环境有关。最近的研究表明这些因子抑制轴突的生长通过异常的活化小GTP酶RhoA有关。促进损伤后的中枢神经系统轴突再生的药物对于限制神经损伤具有非常重要的作用。姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分,是植物界很稀少的具有二酮的色素,为二酮类化合物。具有多种药理活性,如抗炎、抗氧化、抑制凋亡、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、增强免疫功能等多种生物学作用,其毒副作用低,具有良好的临床应用潜力。ASC-J9是姜黄素的双甲氧基衍生物,在亨廷顿病的动物模型中显著延长了动物的生存期,改善疾病的表型,保护运动神经元。本研究应用神经元样细胞(NSC-34细胞),稳定表达野生型TDP-43及突变型TDP-43(Q331K,M337V突变)的稳定转染细胞系以及原代培养的野生型小鼠及G93A-SOD1突变小鼠的脊髓星形胶质细胞,观察Nrf2-ARE通路与星形胶质细胞中氧化损伤,线粒体保护以及氧化应激敏感性的关系；TDP-43蛋白及其毒性片段以及SOD1蛋白的清除与选择性自噬通路的关系；观察表达突变型TDP-43蛋白的细胞中自噬通路活性的改变,自噬过程的主要步骤有无障碍及发生障碍的可能原因。并选用姜黄素及其双甲氧基衍生物ASC-J9进行干预,评价干预前后氧化损伤,线粒体保护,氧化应激敏感性改变,突变蛋白清除以及自噬通路中主要步骤的改变和自噬活性的改变,并对神经保护作用机制进行初步探讨。本研究分四部分,现将各部分内容概述如下。第一部分姜黄素活化Nrf2-ARE通路保护原代培养星形胶质细胞抵抗氧化应激损伤目的：本研究的目的是检测姜黄素是否对原代培养的星形胶质细胞氧化损伤具有保护作用以及原代培养的星形胶质细胞中Nrf2-ARE通路的活化与细胞保护作用之间的关系。方法：本研究中使用了Nrf2+/+和Nrf2-/-的转基因小鼠。动物基因型的鉴定通过PCR扩增的方法鉴定由鼠尾提取的基因组DNA。应用原代星形胶质细胞培养的方法从Nrf2+/+和Nrf2-/-的转基因小鼠脊髓组织中提取原代星形胶质细胞；并检测原代星形胶质细胞胞内活性氧族含量；原代星形胶质细胞的细胞毒性是通过检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)释放量来反映；细胞活力检测以及使用流式细胞分析技术检测线粒体膜电位的变化。结果：姜黄素保护原代培养的Nrf2+/+星形胶质细胞抵御由过氧化氢造成的氧化损伤,并且Nrf2-ARE通路在原代星形胶质细胞中可以被姜黄素显著地活化。给予Nrf2+/+星形胶质细胞姜黄素处理,显著地减少了胞内活性氧族的产生。然而,姜黄素处理后的Nrf2-/-星形胶质细胞未见到明显的胞内活性氧族产生的减少。姜黄素处理后显著地减少了Nrf2+/+星形胶质细胞中线粒体膜电位的下降,Nrf2-/-星形胶质细胞未见到明显的线粒体保护作用。给予Nrf2+/+星形胶质细胞姜黄素预处理,显著降低了细胞对过氧化氢诱导的氧化应激的敏感性。然而,在Nrf2-/-星形胶质细胞中,姜黄素预处理仅有稍许细胞保护作用和对过氧化氢诱导的氧化应激的敏感性的下降。结论：在Nrf2+/+的转基因小鼠脊髓原代培养的星形胶质细胞中姜黄素显著地活化Nrf2靶基因,减少胞内活性氧族,减少线粒体的功能障碍,降低氧化损伤。第二部分ASC-J9对肌萎缩侧索硬化细胞模型的保护作用及机制探讨目的：本研究目的是检测ASC-J9对突变型TDP-43蛋白及其C-末端片段,胞浆不可溶性TDP-43聚集体,可溶性TDP-43蛋白,突变型SOD1蛋白的降解作用和ASC-J9的细胞保护作用以及其内在机制的探讨。方法：为检测可溶性及不可溶性TDP-43蛋白含量的多少,我们对整个细胞蛋白提取物中TDP-43蛋白进行序列性提取；应用免疫共沉淀的方法检测TDP-43蛋白与p62蛋白的相互作用及TDP-43蛋白与泛素的相互作用；还应用反转录PCR检测转录水平变化；应用小干扰RNA的方法进行基因沉默；应用免疫荧光,免疫印迹(western blot)的方法检测蛋白表达的变化。结果：本研究结果表明5-hydroxy-1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3-one (ASC-J9)活化质量控制性自噬,上调自噬性受体蛋白p62和Nbr1的表达并同时活化自噬体形成,选择性地促进突变型全长TDP-43蛋白,及其25kDa和35kDa C-末端片段以及突变的SOD1蛋白的降解。用基因沉默的方法敲降p62的蛋白表达水平,阻止了ASC-J9对TDP-43,及其25kDa和35kDa C-末端片段的降解。此外,ASC-J9同时降低了可溶性及不可溶性突变TDP-43蛋白水平。我们发现神经元样细胞(NSC-34)中表达突变型TDP-43蛋白会导致轴突的wallerian样变性。有趣的是,ASC-J9显著地促进了轴突的外向性生长同时减少轴突的神经变性表型。结论：我们的研究结果表明ASC-J9通过活化质量控制性自噬,选择性地降解突变的全长TDP-43蛋白,及其25kDa和35kDa C-末端片段以及突变的SOD1蛋白,改变了突变细胞的神经变性表型。ASC-J9可能是一个潜在的治疗TDP-43相关蛋白变性疾病和聚集相关疾病候选治疗药物。第三部分ASC-J9活化选择性自噬抑制RhoA信号通路促进神经元样细胞轴突再生及生长圆锥的扩展目的：本研究目的是检测ASC-J9对运动神经元样细胞(NSC-34细胞)轴突再生,生长圆锥扩展以及F-actin细胞骨架的作用。由于ASC-J9活化选择性自噬,我们进一步探讨自噬通路活化与RhoA通路抑制之间的关系。方法：我们应用NSC-34细胞系。NSC-34细胞系是鼠胚胎脊髓运动神经元和鼠成神经瘤细胞杂交的神经元细胞系,具有运动神经元样的特性。还应用小RNA干扰方法降低Nrf2,p62蛋白表达水平；NSC-34细胞中下调Nrf2,p62蛋白表达通过使用转染剂lipofectamine2000进行瞬时转染Nrf2,p62siRNA的方法来实现。结果：在目前的研究中,我们发现ASC-J9显著地促进NSC-34细胞轴突的外向型生长,生长圆锥的外延和F-actin细胞骨架的重构,这些效应可以被同时给予自噬的抑制剂或p62敲降所抑制；为了排除ASC-J9是通过促进NSC-34细胞向更加成熟的运动神经元分化而导致的轴突生长,我们预先给予NSC-34细胞促分化培养基培养进行预分化,预分化后的NSC-34细胞仍然给予ASC-J9处理,观察到ASC-J9仍然具有促进NSC-34细胞轴突的外向型生长的作用,促进生长圆锥的外延和F-actin细胞骨架的重构；ASC-J9促进轴突的外向型生长效应通过抑制RhoA通路来实现并且ASC-J9对RhoA通路的抑制效应被同时给予自噬的抑制剂或p62蛋白敲降所抑制。结论：ASC-J9通过抑制RhoA通路促进运动神经元样细胞轴突再生,生长圆锥扩展及F-actin细胞骨架重构；选择性自噬在轴突再生和RhoA通路抑制的过程中发挥着重要的作用。第四部分表达突变型TDP-43细胞中自噬通路功能改变及机制探讨目的：本研究对稳定表达全长型TDP-43蛋白的细胞中自噬通路的活性进行检测,找出自噬通路活性降低的关键环节并对其机制进行研究。探讨姜黄素衍生物ASC-J9与改善自噬通路活性的关系及内在机制。方法：我们使用了稳定表达野生型和突变型TDP.43的细胞系。应用瞬时转染的方法转染mcherry-lamp2, mcherry-GFP-LC3B, HDAC6.DC-FLAG.HDAC6.△BUZ.FLAG和HDAC6-FLAG表达质粒。此外,应用免疫共沉淀,免疫印迹等试验方法检测蛋白的表达及相互作用。结果：我们发现在表达野生型全长TDP-43的细胞中,溶酶体被富集到细胞核周的区域,这一区域与微管组织中心相一致。然而,在表达突变型全长TDP-43的细胞中,溶酶体呈散在分布。这些数据表明表达突变型全长TDP-43的细胞中,溶酶体的转运和富集存在一定的障碍。我们应用pH敏感的,GFP和mCherry双荧光标记的LC3B报告质粒来检测自噬体和溶酶体融合情况。发现表达突变型全长TDP-43的细胞中存在自噬体和溶酶体融合障碍。我们还观察到表达突变型TDP-43细胞与表达野生型TDP-43的细胞相比,自噬活性显著下降。当突变型TDP-43细胞中重新转染全长型HDAC6质粒时,损伤的自噬体和溶酶体融合,溶酶体富集的障碍以及自噬性降解能力得以恢复。结论：表达突变型TDP-43的细胞中,去乙酰化酶HDAC6的水平降低导致溶酶体转运异常以及自噬体和溶酶体的融合异常,最终导致自噬性清除毒性蛋白的功能障碍以及细胞毒性的产生。ASC-J9处理后逆转了此过程。因此,ASC-J9可能是针对TDP-43蛋白病的潜在的有效治疗方法。