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目的:当人们处于紧张、压力环境中或受到心肌缺血、高血压等病理刺激时,交感神经系统（sympathetic nervous system,SNS）过度兴奋,使得内源性儿茶酚胺升高,导致心脏β-肾上腺素受体（β-adrenergic receptor,β-AR）过度激活,发生交感风暴。交感风暴的发生不仅会引发而且会加重一系列心血管损伤,如血栓形成、心脏重塑、心脏电活动不稳定等,其中心脏炎症是心脏损伤的早期中心环节。课题组前期研究发现,β-AR的过度激活会引发心脏NLR家族pyrin结构域蛋白3（NLR Family Pyrin Domain Containing 3,NLRP3）炎症小体剪切激活,从而触发心脏炎症。但目前临床上仍十分缺乏抑制心脏NLRP3炎症小体早期激活的药物,因此,寻找能有效抑制NLRP3炎症小体激活的药物和干预靶点,从而减轻心脏重构和心功能下降十分必要。白藜芦醇（resveratrol,RES）在最近的临床实验中显示出良好的抗炎作用,但其是否可以抑制因急性交感应激引起的心脏NLRP3炎症小体激活并减轻心脏炎症损伤及其作用靶点尚不清楚。因此,本课题拟用肾上腺素受体激动剂异丙基肾上腺素（isoproterenol,ISO）模拟小鼠急性交感应激引起心脏炎症损伤,明确白藜芦醇是否通过抑制心脏NLRP3炎症小体激活使急性交感应激引起的心脏炎症损伤减轻,进一步分析其作用靶点。为此,本研究借助网络药理学方法和计算机模拟分子对接方法预测白藜芦醇潜在作用靶点,利用表面等离子体共振（surface plasmon resonance,SPR）实验、体外激酶实验及动物、细胞实验等方法,从多个角度探讨白藜芦醇减轻急性交感应激引起心脏炎症损伤的作用及其药理机制,为今后白藜芦醇的药物研发和临床治疗急性交感应激致心肌损伤的用药提供实验依据。方法:1.小鼠在体实验证实白藜芦醇可以减轻急性交感应激引起的心脏炎症损伤。实验分为Control组（生理盐水注射组）、ISO组（异丙基肾上腺素处理组）、ISO+RES组（白藜芦醇预处理+异丙基肾上腺素处理组）和RES组（白藜芦醇单独处理组）。给予小鼠白藜芦醇连续灌胃4天,20 mg/kg/day,第四天给予ISO皮下注射一次（5 mg/kg）,第7天取材心脏组织,利用MAC-3（巨噬细胞标志物）染色法分析心脏巨噬细胞浸润情况,采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠心脏组织中巨噬细胞趋化因子单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）和单核细胞趋化蛋白-5（Monocyte chemoattractant protein-5,MCP-5）的含量以及促炎细胞因子白介素6（Interleukin 6,IL-6）和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的含量。2.小鼠在体实验证实白藜芦醇可以抑制心脏NLRP3炎症小体激活。实验分为Control组（生理盐水注射组）、ISO组（异丙基肾上腺素处理组）、ISO+RES组（白藜芦醇预处理+异丙基肾上腺素处理组）和RES组（白藜芦醇单独处理组）。利用蛋白质免疫印迹实验（Western blot,WB）检测各组心脏组织中NLRP3炎症小体（NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1（P20）、pro-IL-18和Cleaved-IL-18）的蛋白表达情况。3.细胞实验证实白藜芦醇抑制乳小鼠心肌细胞（Neonatal Mice Cardiomyocytes,NMCMs）NLRP3炎症小体激活。实验分为Control组、ISO组、ISO+低、中剂量RES组（0.1、10μM）。给予NMCMs白藜芦醇（0.1、10μM）预处理30 min,ISO（10μM）处理1 h。CCK-8比色法检测不同浓度下白藜芦醇对乳小鼠心肌细胞存活率的影响。WB方法检测各组NLRP3炎症小体（NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1（P20）、pro-IL-18、Cleaved-IL-18）的蛋白表达情况。4.通过网络药理学疾病基因数据库进行白藜芦醇、交感应激和心肌炎症共有靶点的预测分析,并应用分子模拟对接证实白藜芦醇与预测靶点的结合效率。首先通过SWISS Target prediction数据库、Gene Cards疾病基因数据库进行白藜芦醇和交感心肌炎症靶点预测分析,进一步将白藜芦醇、交感应激和心肌炎症的靶点放入Bioinformatics＆Evolutionary Genomics数据库进行交集,得到白藜芦醇、交感应激和心肌炎症共有靶点的韦恩图。再通过String数据库分析得到蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络图。最后将数据结果导入Cytoscape＿v3.6软件,得到白藜芦醇-交感应激-心肌炎症的共有靶点。5.体外实验及细胞实验验证网络药理学预测靶点与白藜芦醇相互作用。通过表面等离子体共振、激酶实验等体外实验方法验证白藜芦醇与预测靶点的结合效率和药理作用。在NMCMs上,WB方法检测在白藜芦醇预处理条件下ISO刺激后预测靶点的蛋白表达变化,并检测抑制预测靶点活性后ISO刺激条件下NLRP3炎症小体各组分的蛋白表达情况。进一步,再利用普萘洛尔（propranolol,Prop）抑制β-AR活性和PKI（PKA抑制剂）抑制PKA活性后,检测预测靶点的蛋白表达变化。结果:1.白藜芦醇对急性交感应激引起的心脏炎症损伤具有抑制作用。MAC-3染色结果显示,与Control组相比,ISO组小鼠心脏组织中MAC-3阳性面积明显增加（P＜0.05）;而RES+ISO组与ISO组相比,小鼠心脏组织中MAC-3阳性面积明显减少（P＜0.05）。ELISA结果同样显示,与Control组相比,ISO组小鼠心脏组织中趋化因子MCP-1、MCP-5和促炎细胞因子IL-6、TNF-α释放增加（P＜0.05）;而RES+ISO组与ISO组相比,MCP-1、MCP-5、IL-6和TNF-α等在内的趋化因子、促炎细胞因子释放显著减少（P＜0.05）。2.白藜芦醇通过抑制心脏NLRP3炎症小体激活减轻急性交感应激引起的心脏炎症损伤。Western blot结果显示,与Control组相比,ISO组小鼠心脏组织中NLRP3、Caspase-1（P20）和Cleaved-IL-18的蛋白表达水平明显升高,pro-Caspase-1和pro-IL-18的蛋白水平表达降低（P＜0.05）;给予白藜芦醇预处理后,与ISO组相比,小鼠心脏组织中NLRP3、Caspase-1（P20）、和Cleaved-IL-18的蛋白表达水平明显降低,pro-Caspase-1和pro-IL-18的蛋白表达水平升高（P＜0.05）。3.白藜芦醇抑制乳小鼠心肌细胞中NLRP3炎症小体激活。Western blot结果显示,与Control组相比,ISO组NMCMs中NLRP3、Caspase-1（P20）和Cleaved-IL-18的蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）;在给予白藜芦醇预处理后,与ISO组相比,NMCMs中NLRP3、Caspase-1（P20）和Cleaved-IL-18的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,同时pro-Caspase-1和pro-IL-18的蛋白表达水平自始至终没有发生变化。4.TCMSP数据库、SWISS数据库、SEA数据库及QSAR数据库预测白藜芦醇潜在候选靶点494个。利用Gene Cards数据库分别获得交感应激靶点及心肌炎症靶点1604、2759个。绘制Venn图,得到白藜芦醇-交感心肌炎症共有靶点179个。根据String数据库中PPI的度值（Degree）确定排名第一的核心靶点AKT1,同时,还有SIRT1。分子对接结果显示白藜芦醇可以与AKT1、SIRT1相互作用形成致密复合物。KEGG富集分析中,白藜芦醇减轻急性交感应激引起的心脏炎症损伤的机制可能与调节PI3K-AKT信号通路密切相关。5.表面等离子体共振实验、激酶实验证实白藜芦醇可以与AKT1纯化蛋白紧密结合并抑制AKT1底物GSK-3β磷酸化;在NMCMs上,Western blot结果显示,与Control组相比,ISO可使AKT1磷酸化水平升高并抑制SIRT1蛋白表达（P＜0.05）;给予白藜芦醇预处理后,与ISO组相比,AKT1磷酸化水平降低且SIRT1蛋白表达升高;进一步发现A-674563（AKT1抑制剂）预处理后,与ISO组相比,NMCMs中NLRP3、Caspase-1（P20）、和Cleaved-IL-18的蛋白表达明显降低（P＜0.05）;与Control组相比,利用普萘洛尔抑制β-AR活性和PKI抑制PKA活性后AKT1磷酸化水平降低（P＜0.05）。结论:白藜芦醇通过作用于AKT1信号分子,减轻急性交感应激导致的心脏炎症损伤。