藤茶中二氢杨梅素的降解行为及其产物生物活性研究

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本论文以藤茶为研究对象,对其总黄酮含量检测方法,二氢杨梅素的分离纯化、降解和降解产物结构进行了研究;并采用体外抗氧化、促氧化、酶抑制和抑菌试验研究了二氢杨梅素及其降解产物的活性,以期为藤茶及二氢杨梅素的合理开发利用提供参考依据。具体研究结果如下:1.运用液质联用(LC-MS)分析鉴定了藤茶总黄酮(TF)中的六个成分,分别为二氢杨梅素、槲皮素、杨梅苷、杨梅素、二氢槲皮素和山奈酚。比较了TF含量测定法中的直接测定法、差示分光光度法、三氯化铝比色法和硝酸铝-亚硝酸钠-氢氧化钠比色法(简称硝酸铝比色法),实验发现:不同的测定方法在不同的环境条件下的测定结果各有差异,比较而言差示分光光度法能较准确测定藤茶原料中总黄酮的含量;当存在单一干扰物时,直接测定法和硝酸铝比色法相对较好;当存在复合干扰物时,三氯化铝比色法测定结果较准确。以TF为原料,采用制备型高效液相色谱纯化二氢杨梅素(DMY),在流动相为甲醇-水(35:65,v/v),洗脱时间为30 min,流速为8 mL/min,进样量为600μL的条件下,所制DMY的纯度为99.50±0.27%,得率为57.99±0.21%。2.采用高效液相色谱检测DMY在体外细胞培养条件(DMEM培养基,37°C,pH 7.4)和模拟生理条件下(PBS,37°C,p H7.4)的降解行为,并用高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪(HPLC-QTOF-MS/MS)分析降解产物的结构。实验结果表明DMY在DMEM培养基与PBS中的降解速率过程均复合一级动力学,半衰期分别为4.01 d和5.50 d。DMY在DMEM培养基和PBS中的降解产物相同。根据MS2图谱信息推测出三种降解产物可能是DMY分别经脱羟基,氧化聚合和还原产生的。3.通过体外化学抗氧化试验和基于细胞的抗氧化、促氧化试验,考察和评价了DMY和二氢杨梅素降解产物混合物(DDPsM)的体外抗氧化和促氧化活性。体外化学抗氧化试验结果表明,DMY、TF和DDPsM对ABTS和DPPH均有一定的清除能力,且DMY的活性更好。FRAP结果显示DMY具有更好的还原能力。基于红细胞的抗氧化试验结果表明,DMY(红细胞溶血率IC50=125.52±1.79μg/mL)对AAPH诱导的红细胞溶血和脂质过氧化的抑制作用优于DDPsM(红细胞溶血率IC50=131.72±2.16μg/mL)。基于细胞的促氧化试验结果表明,DDPsM的促进作用强于DMY。4.通过体外酶抑制和抑菌试验,考察了DMY、TF和DDPs M的体外降糖和抑菌活性。体外酶抑制试验结果表明,DDPs M(IC50=0.132±0.0031 mg/mL)和TF(IC50=0.391±0.010 mg/mL)抑制α-葡萄糖苷酶的作用更强,明显强于DMY(IC50=2.986±0.073 mg/mL)和阳性对照阿卡波糖(IC50=1.511±0.027 mg/mL);而DDPsM(IC50=1.114±0.020 mg/mL)和DMY(IC50=1.442±0.029 mg/mL)抑制α-淀粉酶的作用强于TF(IC50=1.589±0.033 mg/mL),但均弱于阿卡波糖(IC50=0.202±0.0053 mg/mL);体外抑菌试验结果表明,金黄色葡萄球菌对DMY(最小杀菌浓度MBC=0.125 mg/mL)、TF(MBC=0.125 mg/mL)和DDPsM(MBC=0.0625 mg/mL)的敏感程度最高,其次是铜绿假单胞菌,且DDPsM和TF的抑菌活性较强。
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