【摘 要】
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长链非编码RNA（lnc RNA）因其参与致癌和肿瘤的发生而备受关注。HOX转录反义RNA（HOTAIR）是一种具有反式作用的lnc RNA,lnc RNA HOTAIR在肿瘤细胞中的过度表达促进肿瘤的生长和转移。转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）也是目前研究最为广泛的lnc RNAs之一,它位于11q13染色体的长臂上,在细胞发育、分化、增殖、入侵和迁移的基因组功能和生物过程的许多方面发挥生
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长链非编码RNA（lnc RNA）因其参与致癌和肿瘤的发生而备受关注。HOX转录反义RNA（HOTAIR）是一种具有反式作用的lnc RNA,lnc RNA HOTAIR在肿瘤细胞中的过度表达促进肿瘤的生长和转移。转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）也是目前研究最为广泛的lnc RNAs之一,它位于11q13染色体的长臂上,在细胞发育、分化、增殖、入侵和迁移的基因组功能和生物过程的许多方面发挥生理和病理作用。本论文聚焦于细胞和组织内的lnc RNA的超灵敏检测,主要包括如下两个工作:1.发展了一种错配的荧光探针直接检测活细胞中lnc RNA HOTAIR表达的方法。该方法反应过程不需要任何酶的参与,也不需要分离未结合的荧光探针。错配的线性寡核苷探针由在5’端BHQ1修饰的捕获探针和在3’端FAM修饰的报告探针相互配对组成。在靶标lnc RNA不存在时,错配的荧光探针在37℃的生理温度下保持稳定,不会产生荧光信号。当靶标lnc RNA存在时,错配荧光探针可以与靶标lnc RNA HOTAIR发生置换反应,释放出荧光信号。荧光探针中错配碱基的引入大大提高了靶标lnc RNA的链置换反应速率。此外,错配探针的稳定性和链置换反应速率两者之间的微妙平衡,使得错配的荧光探针可以直接检测活细胞中lnc RNA的表达水平。这些错配的荧光探针可以检测各种细胞系中的lnc RNA的表达水平,并可以区分癌细胞与正常细胞,在基础生物医学领域、临床诊断和疾病治疗具有潜在应用价值。2.发展了一种基于连接依赖性转录扩增的单分子计数法同时检测癌细胞和组织中多个lnc RNA的超灵敏检测方法。我们设计了与靶标lnc RNA互补配对的两个模板,其中一个模板中含有T7RNA聚合酶识别启动子序列。当靶标lnc RNA存在时,两段模板发生连接反应引发T7RNA聚合酶介导的转录反应,生成大量RNA产物。生成的RNA产物又可以引发连接反应-T7RNA聚合酶聚合-连接反应的循环发生,进而产生更多的RNA产物。当两种靶标同时存在时,通过连接-转录反应产生不同的RNA产物。这些不同的转录产物与不同荧光标记的信号探针杂交形成DNA/RNA杂交链,与磁珠连接后启动双链特异性核酸酶（DSN）辅助的循环切割信号探针反应。荧光分子经磁分离从反应溶液中分离,利用单分子检测进行计数。该方法非常灵敏,检测靶标MALAT1和HOTAIR的检测限分别为0.126 a M和0.043 a M,可以区分癌细胞和正常细胞。另外,该方法可以在单细胞水平上同时检测多个内源性lnc RNAs,可进一步应用于区分NSCLC患者组织和健康人组织中lnc RNA的表达,为lnc RNAs相关医学研究和临床诊断提供了一种新方法。
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