基于主客体作用的电化学及电致化学发光生物传感器的构建及应用

来源 :山东师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lkks06
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超分子化学是化学、生物化学和材料科学中一个高度交叉和快速发展的研究领域。超分子的结合是以分子识别(即主客体识别)为基础的。主客体识别是主体对客体选择性结合并产生特定功能超分子的过程,包括酶和底物选择性相互作用、DNA和蛋白特异性相互作用、DNA和RNA中碱基间的氢键引导相互作用、抗原抗体相互作用等。主客体化学作为超分子化学的一个重要研究领域,在化学传感领域具有巨大应用潜力,在分析化学、传感器、环境监测和生物医学领域得到了广泛应用。本论文将主客体相互作用应用于构建生物分析传感平台,发展了一系列操作简单、灵敏度高和特异性强的电化学和电致化学发光生物传感器,实现了对尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase,UDG)和甲基转移酶(M.Sss I Methyltransferases,M.Sss I MTase)的高灵敏、高选择性检测。我们开发了一种低背景电化学生物传感器,用于一步检测尿嘧啶DNA糖基化酶。该传感器利用主客体相互作用和铁嵌入富氮碳纳米管(Fe-N-C)模拟酶介导的电催化实现信号放大。在本工作中,我们首先将Fe-N-C固定在玻碳电极上,然后固定β-环糊精(β-CD)。我们通过在金纳米粒子(Au NPs)表面组装亚甲基蓝(MB)标记的发夹DNA构建MB-hairpin/Au NPs信号探针。由于Au NPs的空间效应和发夹DNA的茎环结构,MB无法进入电极上β-CD的空腔。当UDG存在时,UDG可以将发夹DNA探针茎上U·A碱基对中的尿嘧啶去除,产生无嘌呤/无嘧啶(AP)位点,随后将MB-hairpin/Au NPs探针通过β-CD与MB的主客体作用组装到电极上。同时,L-半胱氨酸(RSH)被O2氧化生成二硫化L-半胱氨酸和H2O2。在H2O2存在时,Fe-N-C催化MB氧化产生放大的电化学信号。值得注意的是,Fe-N-C催化MB氧化是由O2氧化RSH介导的,而不是外部的H2O2,大大简化了实验程序,改善了电化学信号。由于引入了主客体识别,该电化学生物传感器具有低背景信号和高信噪比,可一步灵敏检测UDG,检测限为7.4×10-5 U m L-1。此外,该生物传感器可以用于检测细胞提取物中的UDG以及筛选抑制剂,为生物医学研究提供了一个新平台。我们将主客体识别与三重信号放大相结合发展了一种新型电致化学发光(ECL)生物传感器,用于灵敏检测尿嘧啶DNA糖基化酶。我们利用二茂铁(Fc)作为客体分子、Fe MOF/Au NPs@luminol作为ECL标签,设计了一种双标记发夹DNA探针。当UDG存在时,它可以从发夹DNA探针茎中除去尿嘧啶,产生AP位点,导致发夹结构展开,随后将Fe MOF/Au NPs@luminol修饰的单链DNA通过Fc和β-CD主客体作用固定在氧化石墨烯修饰的玻碳电极上。Fe MOF中的Fe3+可以在酸性条件下与亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)反应生成普鲁士蓝。随后普鲁士蓝催化H2O2沉积生成羟基自由基(OH·),OH·与鲁米诺自由基反应生成3-氨基邻苯二甲酸(AP2-*),产生增强ECL信号。该传感器具有三重信号放大,包括:(1)电化学氧化的Fc(Fc+)催化H2O2分解生成AP2-*;(2)Fe MOF/Au NPs@luminol探针负载大量鲁米诺分子,有效放大ECL信号;(3)普鲁士蓝在H2O2作用下催化鲁米诺自由基生成AP2-*。该生物传感器具有良好选择性和较高灵敏度,优于已报道的生物传感器。此外,该生物传感器可用于UDG抑制剂的筛选和细胞UDG活性的测定,在临床诊断和药物研发中具有潜在应用价值。我们开发了一种基于主客体相互作用和金属有机凝胶的具有聚集诱导电致化学发光(ECL)增强的生物传感器,用于M.Sss I甲基转移酶的超灵敏检测。金属有机凝胶(MOGs)是一种新型的软质材料,具有高胶体稳定性、发光性能好、合成方便等特点。该生物传感器以MOG为发光材料,以过硫酸钾为共反应物,通过银纳米团簇的聚集诱导发光产生增强ECL信号。在该传感器中,含有特异性识别序列5′-CCGG-3′的两条互补单链DNA(ss DNAs,生物素化的DNA-1和Fc标记的DNA-2)杂交形成双链DNA(ds DNA)探针。当没有M.Sss I MTase存在时,ds DNA探针被限制性内切酶Hpa II消化,导致Fc从磁珠解离。释放的Fc通过主客体相互作用与β-CD特异性识别,导致ECL信号猝灭。当M.Sss I MTase存在时,完全甲基化的ds DNA不能被Hpa II切割,Fc保留在磁珠表面,产生增强ECL信号。该生物传感器的线性范围为0.05~100 U m L-1,检测限为3.5×10-3 U m L-1,可准确检测人血清中的M.Sss I MTase。该生物传感器可以进一步应用于抑制剂筛选,在药物研发和疾病诊断中具有广泛应用前景。
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