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第一部分荷瘤裸鼠体内双靶点靶向肿瘤干细胞的放射免疫治疗研究
目的
在结直肠癌(CRC)异种移植瘤中以肿瘤干细胞(CSCs)两种生物标志物(CD133和CD44)为治疗靶点，评价使用特异性靶向CSCs的放射性标记单克隆抗体(mAbs)进行放射免疫治疗(RIT)的疗效，并探讨131I-CD133mAb和131I-CD44mAb配伍使用的相对优势。
方法
采用Iodogen法制备放射性碘标记抗体，构建HT29荷瘤裸鼠模型。实验分为8组，每组14只，分别经尾静脉注射：A组(生理盐水组)每只注射100μl生理盐水；B组(CD133mAb组)每只注射20μg/100μl的CD133mAb；C组(CD133mAb/CD44mAb配伍使用组)每只注射10μg/50μl的CD133mAb和10μg/50μl的CD44mAb；D组(CD44mAb组)每只注射20μg/100μl的CD44mAb；E组(131I-IgG同型对照组)每只注射14.8MBq/100μl的131I-IgG；F组(131I-CD133mAb组)每只注射14.8MBq/100μl的131I-CD133mAb；G组(131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组)每只注射7.4MBq/50μl的131I-CD133mAb和7.4MBq/50μl的131I-CD44mAb；H组(131I-CD44mAb组)每只注射14.8MBq/100μl的131I-CD44mAb。注射后每天监测荷瘤裸鼠的生存状态。每3天测量一次荷瘤裸鼠的体重和肿瘤大小。通过肿瘤生长曲线和荷瘤裸鼠生存曲线评估各组治疗效果。注射后第30天时，通过TUNEL免疫荧光染色、Ki67免疫组织化学染色和流式细胞分析，分别检测各组荷瘤裸鼠异种移植瘤中的细胞凋亡、细胞增殖情况和细胞表面生物标志物的表达水平。
结果
1.131I-IgG、131I-CD133mAb、131I-CD44mAb的平均标记率(n=4)分别为67.62±3.86%、74.41±4.65%、71.27±4.22%，平均放射性比活度(n=4)分别为13.57±0.81μCi/μg、15.18±0.54μCi/μg、14.36±0.79μCi/μg，纯化后的平均放射性化学纯度(n=4)分别为88.91±1.66%、93.37±2.79%、91.08±2.38%。标记抗体在体外培养条件下一定时间内具有较稳定的性质。
2.各组中荷瘤裸鼠在开始进行RIT实验时的初始体重没有显著性统计学差异(P=0.915)，初始平均肿瘤体积也没有显著性统计学差异(P=1.000)。肿瘤生长曲线显示，核素靶向治疗组(F组、G组和H组)与其它五组相比表现出明显的肿瘤生长延迟。注射后第30天，核素靶向治疗组中荷瘤裸鼠的平均肿瘤体积显著小于其它五个组(P<0.001)。进一步分析显示，H组中肿瘤裸鼠的平均肿瘤体积显著小于F组(P=0.018)。荷瘤裸鼠生存曲线显示，核素靶向治疗组的中位生存时间与其它五个组相比明显延长，其中H组中荷瘤裸鼠的中位生存时间明显大于F组(P=0.026)，而与G组相比无显著性统计学差异(P=0.592)。G组中肿瘤裸鼠的中位生存时间与F组相比也无显著性统计学差异(P=0.084)。
3.TUNEL免疫荧光染色结果显示，注射后第30天时核素靶向治疗组中肿瘤组织的细胞凋亡(绿色荧光)明显多于其它五个组。定量分析结果显示，核素靶向治疗组肿瘤组织中TUNEL+细胞的百分比显著高于其它五个组(P<0.001)，其中H组肿瘤组织中TUNEL+细胞的百分比显著高于G组(P=0.001)，而G组肿瘤组织中TUNEL+细胞的百分比又显著高于F组(P<0.001)。
4.Ki67免疫组织化学染色结果显示，注射后第30天时核素靶向治疗组肿瘤组织的细胞增殖(棕褐色)明显少于其它五个组。定量分析结果显示，核素靶向治疗组肿瘤组织中Ki67+细胞的百分比显著低于其它五个组(P<0.001)，其中H组肿瘤组织中Ki67+细胞的百分比显著低于G组(P=0.011)，而G组中Ki67+细胞的百分比又显著低于F组(P<0.001)。
5.流式细胞检测结果显示，注射后第30天时核素靶向治疗组中肿瘤组织的CD133和CD44表达水平和CD133+细胞、CD44+细胞、CD133+/CD44+细胞的平均百分比都显著低于其它五个组(P<0.001)。F组肿瘤组织中CD133+细胞的平均百分比显著低于G组和H组(P<0.001)，且G组肿瘤组织中CD133+细胞的平均百分比又显著低于H组(P=0.021)。H组肿瘤组织中CD44+细胞的平均百分比显著低于G组和F组(P<0.001)，且G组肿瘤组织中CD44+细胞的平均百分比又显著低于F组(P<0.001)。G组肿瘤组织中CD133+/CD44+细胞的平均百分比显著低于H组和F组(分别为P=0.006和P=0.040)。
结论
放射性标记的特异性靶向CSCs生物标志物(CD133和CD44)的mAbs可以通过诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖而有效地清除肿瘤病灶中的CSCs，从而达到抑制肿瘤生长和延长生存时间的目的。131I-CD133mAb和131I-CD44mAb的配伍使用虽然在相同治疗剂量下的抑瘤效果并不优于131I-CD44mAb单靶点治疗，但对肿瘤组织中CD133+/CD44+细胞的清除多于单靶点治疗，从而可能产生增强的CSCs靶向清除能力。
第二部分诊疗一体化探针动态监测靶向肿瘤干细胞RIT疗效的初步研究
目的
以放射性核素131I标记的特异性靶向肿瘤干细胞(CSCs)两种表面生物标志物(CD133和CD44)的单克隆抗体(mAbs)为诊疗一体化探针，通过荷瘤裸鼠在体单光子发射计算机断层扫描(SPECT)显像、生物分布分析以及肿瘤组织的免疫组织化学和蛋白免疫印迹实验，评价放射性核素标记抗体在体内靶向CSCs的特异性以及CSCs的动态变化，探讨靶向CSCs的放射免疫治疗(RIT)中通过放射免疫显像(RII)进行CSCs动态监测的可行性以及双靶点RII的相对优势。
方法
采用Iodogen法制备放射性核素标记mAbs，构建HT29荷瘤裸鼠模型，分为4组(每组20只)进行尾静脉注射：131I-IgG同型对照组每只注射14.8MBq/100μl的131I-IgG；131I-CD133mAb组每只注射14.8MBq/100μl的131I-CD133mAb；131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组每只注射7.4MBq/50μl的131I-CD133mAb和7.4MBq/50μl的131I-CD44mAb；131I-CD44mAb组每只注射14.8MBq/100μl的131I-CD44mAb。注射后第1天、第5天、第10天、第15天、第20天和第25天时，通过荷瘤裸鼠在体SPECT显像动态监测各组治疗反应。注射后第5天、第10天、第15天和第20天时，通过荷瘤裸鼠体内全身生物分布研究、肿瘤组织免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹实验，分别检测各组荷瘤裸鼠的肿瘤放射性摄取、细胞表面生物标志物CD133和CD44的表达水平。
结果
1.荷瘤裸鼠在体SPECT显像显示，注射后第1天，这4组中的荷瘤裸鼠肿瘤部位均未见显影。131I-CD44mAb组肿瘤部位在注射后第5天开始显影，注射后第10天显影清晰并明显强于其它组，注射后第15、20和25天显影弱于其它两个核素靶向治疗组。131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组肿瘤部位在注射后第10天开始显影，注射后第15、20和25天时显影越来越明显，并且显影清晰度介于其它两个核素靶向治疗组之间。131I-CD133mAb组肿瘤部位在注射后第15天开始显影，此后显影逐渐增强，并且在注射后第15、20和25天时显影强于其它两个核素靶向治疗组。131I-IgG组肿瘤部位直至第20天才开始隐约可见显影，第25天显影较前清晰，但是显著弱于核素靶向治疗组。
2.生物分布实验结果显示，核素靶向治疗组肿瘤放射性摄取(%ID/g)以及肿瘤/本底放射性摄取比值(T/B )比值，在每个时间点均显著高于131I-IgG组(均为P<0.001)。注射后第5天，131I-CD44mAb组的肿瘤%ID/g和T/B比值均显著高于131I-CD133mAb组(均为P<0.05)；注射后第10天，除了131I-CD44mAb组的肿瘤%ID/g和T/B比值仍然显著高于131I-CD133mAb组(均为P<0.05)之外，131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组的T/B比值亦显著高于131I-CD133mAb组(P<0.001)。但是此后出现反向变化：注射后第15天时131I-CD133mAb组和131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组的肿瘤%ID/g和T/B比值反而均显著高于131I-CD44mAb组(均为P<0.01)，且131I-CD133mAb组的T/B比值亦显著高于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组(P<0.001)；注射后第20天，131I-CD133mAb组肿瘤%ID/g和T/B比值均显著高于131I-CD44mAb组(均为P<0.01)，且131I-CD133mAb组T/B比值显著高于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组(P<0.05)。
3.免疫组织化学染色结果显示，核素靶向治疗组肿瘤组织的棕色染色区域明显少于131I-IgG组。光密度分析结果显示，核素靶向治疗组CD133和CD44的平均积分光密度值(IOD)在每个时间点均明显低于131I-IgG组(均为P<0.01)。131I-CD133mAb组注射后第5、10、15和20天的CD133平均IOD显著低于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组与131I-CD44mAb组(均为P<0.01)，且131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组注射后第15天和第20天的CD133平均IOD显著低于131I-CD44mAb组(均为P<0.05)。131I-CD44mAb组注射后第5、10、15和20天的CD44平均IOD显著低于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组与131I-CD133mAb组(均为P<0.01)，且131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组注射后第10天和第20天的CD44平均IOD也显著低于131I-CD133mAb组(均为P<0.05)。
4.蛋白免疫印迹条带图像显示，核素靶向治疗组肿瘤组织的CD133和CD44表达水平明显低于131I-IgG组。光密度分析结果显示，核素靶向治疗组CD133和CD44的平均信号强度在每个时间点均明显低于131I-IgG组(均为P<0.01)。131I-CD133mAb组注射后第5、10、15和20天的CD133相对信号强度显著低于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组和131I-CD44mAb组(均为P<0.001)，而131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组CD133相对信号强度又显著低于131I-CD44mAb组(均为P<0.001)。131I-CD44mAb组注射后第5、10、15和20天的CD44相对信号强度显著低于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组与131I-CD133mAb组(均为P<0.001)，且131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组注射后第5、10和20天的CD44相对信号强度又显著低于131I-CD133mAb组(均为P<0.05)。
结论
放射性核素标记的特异性靶向CSCs的mAbs在荷瘤裸鼠中的SPECT显像和生物分布与通过免疫组织化学和蛋白免疫印迹实验检测的肿瘤组织CD133和CD44表达水平一致，表明应用放射性核素标记的特异性靶向CSCs的mAbs作为放射性核素诊疗一体化探针用于RIT中CSCs动态RII监测的可行性。131I-CD133mAb和131I-CD44mAb的配伍使用不一定能得到比单一抗体更佳的RII结果，但其可以特异性监测CSCs动态变化作为RIT疗效的评价指标。
目的
在结直肠癌(CRC)异种移植瘤中以肿瘤干细胞(CSCs)两种生物标志物(CD133和CD44)为治疗靶点，评价使用特异性靶向CSCs的放射性标记单克隆抗体(mAbs)进行放射免疫治疗(RIT)的疗效，并探讨131I-CD133mAb和131I-CD44mAb配伍使用的相对优势。
方法
采用Iodogen法制备放射性碘标记抗体，构建HT29荷瘤裸鼠模型。实验分为8组，每组14只，分别经尾静脉注射：A组(生理盐水组)每只注射100μl生理盐水；B组(CD133mAb组)每只注射20μg/100μl的CD133mAb；C组(CD133mAb/CD44mAb配伍使用组)每只注射10μg/50μl的CD133mAb和10μg/50μl的CD44mAb；D组(CD44mAb组)每只注射20μg/100μl的CD44mAb；E组(131I-IgG同型对照组)每只注射14.8MBq/100μl的131I-IgG；F组(131I-CD133mAb组)每只注射14.8MBq/100μl的131I-CD133mAb；G组(131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组)每只注射7.4MBq/50μl的131I-CD133mAb和7.4MBq/50μl的131I-CD44mAb；H组(131I-CD44mAb组)每只注射14.8MBq/100μl的131I-CD44mAb。注射后每天监测荷瘤裸鼠的生存状态。每3天测量一次荷瘤裸鼠的体重和肿瘤大小。通过肿瘤生长曲线和荷瘤裸鼠生存曲线评估各组治疗效果。注射后第30天时，通过TUNEL免疫荧光染色、Ki67免疫组织化学染色和流式细胞分析，分别检测各组荷瘤裸鼠异种移植瘤中的细胞凋亡、细胞增殖情况和细胞表面生物标志物的表达水平。
结果
1.131I-IgG、131I-CD133mAb、131I-CD44mAb的平均标记率(n=4)分别为67.62±3.86%、74.41±4.65%、71.27±4.22%，平均放射性比活度(n=4)分别为13.57±0.81μCi/μg、15.18±0.54μCi/μg、14.36±0.79μCi/μg，纯化后的平均放射性化学纯度(n=4)分别为88.91±1.66%、93.37±2.79%、91.08±2.38%。标记抗体在体外培养条件下一定时间内具有较稳定的性质。
2.各组中荷瘤裸鼠在开始进行RIT实验时的初始体重没有显著性统计学差异(P=0.915)，初始平均肿瘤体积也没有显著性统计学差异(P=1.000)。肿瘤生长曲线显示，核素靶向治疗组(F组、G组和H组)与其它五组相比表现出明显的肿瘤生长延迟。注射后第30天，核素靶向治疗组中荷瘤裸鼠的平均肿瘤体积显著小于其它五个组(P<0.001)。进一步分析显示，H组中肿瘤裸鼠的平均肿瘤体积显著小于F组(P=0.018)。荷瘤裸鼠生存曲线显示，核素靶向治疗组的中位生存时间与其它五个组相比明显延长，其中H组中荷瘤裸鼠的中位生存时间明显大于F组(P=0.026)，而与G组相比无显著性统计学差异(P=0.592)。G组中肿瘤裸鼠的中位生存时间与F组相比也无显著性统计学差异(P=0.084)。
3.TUNEL免疫荧光染色结果显示，注射后第30天时核素靶向治疗组中肿瘤组织的细胞凋亡(绿色荧光)明显多于其它五个组。定量分析结果显示，核素靶向治疗组肿瘤组织中TUNEL+细胞的百分比显著高于其它五个组(P<0.001)，其中H组肿瘤组织中TUNEL+细胞的百分比显著高于G组(P=0.001)，而G组肿瘤组织中TUNEL+细胞的百分比又显著高于F组(P<0.001)。
4.Ki67免疫组织化学染色结果显示，注射后第30天时核素靶向治疗组肿瘤组织的细胞增殖(棕褐色)明显少于其它五个组。定量分析结果显示，核素靶向治疗组肿瘤组织中Ki67+细胞的百分比显著低于其它五个组(P<0.001)，其中H组肿瘤组织中Ki67+细胞的百分比显著低于G组(P=0.011)，而G组中Ki67+细胞的百分比又显著低于F组(P<0.001)。
5.流式细胞检测结果显示，注射后第30天时核素靶向治疗组中肿瘤组织的CD133和CD44表达水平和CD133+细胞、CD44+细胞、CD133+/CD44+细胞的平均百分比都显著低于其它五个组(P<0.001)。F组肿瘤组织中CD133+细胞的平均百分比显著低于G组和H组(P<0.001)，且G组肿瘤组织中CD133+细胞的平均百分比又显著低于H组(P=0.021)。H组肿瘤组织中CD44+细胞的平均百分比显著低于G组和F组(P<0.001)，且G组肿瘤组织中CD44+细胞的平均百分比又显著低于F组(P<0.001)。G组肿瘤组织中CD133+/CD44+细胞的平均百分比显著低于H组和F组(分别为P=0.006和P=0.040)。
结论
放射性标记的特异性靶向CSCs生物标志物(CD133和CD44)的mAbs可以通过诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖而有效地清除肿瘤病灶中的CSCs，从而达到抑制肿瘤生长和延长生存时间的目的。131I-CD133mAb和131I-CD44mAb的配伍使用虽然在相同治疗剂量下的抑瘤效果并不优于131I-CD44mAb单靶点治疗，但对肿瘤组织中CD133+/CD44+细胞的清除多于单靶点治疗，从而可能产生增强的CSCs靶向清除能力。
第二部分诊疗一体化探针动态监测靶向肿瘤干细胞RIT疗效的初步研究
目的
以放射性核素131I标记的特异性靶向肿瘤干细胞(CSCs)两种表面生物标志物(CD133和CD44)的单克隆抗体(mAbs)为诊疗一体化探针，通过荷瘤裸鼠在体单光子发射计算机断层扫描(SPECT)显像、生物分布分析以及肿瘤组织的免疫组织化学和蛋白免疫印迹实验，评价放射性核素标记抗体在体内靶向CSCs的特异性以及CSCs的动态变化，探讨靶向CSCs的放射免疫治疗(RIT)中通过放射免疫显像(RII)进行CSCs动态监测的可行性以及双靶点RII的相对优势。
方法
采用Iodogen法制备放射性核素标记mAbs，构建HT29荷瘤裸鼠模型，分为4组(每组20只)进行尾静脉注射：131I-IgG同型对照组每只注射14.8MBq/100μl的131I-IgG；131I-CD133mAb组每只注射14.8MBq/100μl的131I-CD133mAb；131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组每只注射7.4MBq/50μl的131I-CD133mAb和7.4MBq/50μl的131I-CD44mAb；131I-CD44mAb组每只注射14.8MBq/100μl的131I-CD44mAb。注射后第1天、第5天、第10天、第15天、第20天和第25天时，通过荷瘤裸鼠在体SPECT显像动态监测各组治疗反应。注射后第5天、第10天、第15天和第20天时，通过荷瘤裸鼠体内全身生物分布研究、肿瘤组织免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹实验，分别检测各组荷瘤裸鼠的肿瘤放射性摄取、细胞表面生物标志物CD133和CD44的表达水平。
结果
1.荷瘤裸鼠在体SPECT显像显示，注射后第1天，这4组中的荷瘤裸鼠肿瘤部位均未见显影。131I-CD44mAb组肿瘤部位在注射后第5天开始显影，注射后第10天显影清晰并明显强于其它组，注射后第15、20和25天显影弱于其它两个核素靶向治疗组。131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组肿瘤部位在注射后第10天开始显影，注射后第15、20和25天时显影越来越明显，并且显影清晰度介于其它两个核素靶向治疗组之间。131I-CD133mAb组肿瘤部位在注射后第15天开始显影，此后显影逐渐增强，并且在注射后第15、20和25天时显影强于其它两个核素靶向治疗组。131I-IgG组肿瘤部位直至第20天才开始隐约可见显影，第25天显影较前清晰，但是显著弱于核素靶向治疗组。
2.生物分布实验结果显示，核素靶向治疗组肿瘤放射性摄取(%ID/g)以及肿瘤/本底放射性摄取比值(T/B )比值，在每个时间点均显著高于131I-IgG组(均为P<0.001)。注射后第5天，131I-CD44mAb组的肿瘤%ID/g和T/B比值均显著高于131I-CD133mAb组(均为P<0.05)；注射后第10天，除了131I-CD44mAb组的肿瘤%ID/g和T/B比值仍然显著高于131I-CD133mAb组(均为P<0.05)之外，131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组的T/B比值亦显著高于131I-CD133mAb组(P<0.001)。但是此后出现反向变化：注射后第15天时131I-CD133mAb组和131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组的肿瘤%ID/g和T/B比值反而均显著高于131I-CD44mAb组(均为P<0.01)，且131I-CD133mAb组的T/B比值亦显著高于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组(P<0.001)；注射后第20天，131I-CD133mAb组肿瘤%ID/g和T/B比值均显著高于131I-CD44mAb组(均为P<0.01)，且131I-CD133mAb组T/B比值显著高于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组(P<0.05)。
3.免疫组织化学染色结果显示，核素靶向治疗组肿瘤组织的棕色染色区域明显少于131I-IgG组。光密度分析结果显示，核素靶向治疗组CD133和CD44的平均积分光密度值(IOD)在每个时间点均明显低于131I-IgG组(均为P<0.01)。131I-CD133mAb组注射后第5、10、15和20天的CD133平均IOD显著低于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组与131I-CD44mAb组(均为P<0.01)，且131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组注射后第15天和第20天的CD133平均IOD显著低于131I-CD44mAb组(均为P<0.05)。131I-CD44mAb组注射后第5、10、15和20天的CD44平均IOD显著低于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组与131I-CD133mAb组(均为P<0.01)，且131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组注射后第10天和第20天的CD44平均IOD也显著低于131I-CD133mAb组(均为P<0.05)。
4.蛋白免疫印迹条带图像显示，核素靶向治疗组肿瘤组织的CD133和CD44表达水平明显低于131I-IgG组。光密度分析结果显示，核素靶向治疗组CD133和CD44的平均信号强度在每个时间点均明显低于131I-IgG组(均为P<0.01)。131I-CD133mAb组注射后第5、10、15和20天的CD133相对信号强度显著低于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组和131I-CD44mAb组(均为P<0.001)，而131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组CD133相对信号强度又显著低于131I-CD44mAb组(均为P<0.001)。131I-CD44mAb组注射后第5、10、15和20天的CD44相对信号强度显著低于131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组与131I-CD133mAb组(均为P<0.001)，且131I-CD133mAb/131I-CD44mAb配伍使用组注射后第5、10和20天的CD44相对信号强度又显著低于131I-CD133mAb组(均为P<0.05)。
结论
放射性核素标记的特异性靶向CSCs的mAbs在荷瘤裸鼠中的SPECT显像和生物分布与通过免疫组织化学和蛋白免疫印迹实验检测的肿瘤组织CD133和CD44表达水平一致，表明应用放射性核素标记的特异性靶向CSCs的mAbs作为放射性核素诊疗一体化探针用于RIT中CSCs动态RII监测的可行性。131I-CD133mAb和131I-CD44mAb的配伍使用不一定能得到比单一抗体更佳的RII结果，但其可以特异性监测CSCs动态变化作为RIT疗效的评价指标。