【摘 要】
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乳酸乳球菌能在肠道内存活,所以常被用做基因工程菌的宿主菌。EGF是一种能够促进表皮细胞增殖与分化的细胞因子。已有研究发现pEGF(猪表皮生长因子)能促进断奶仔猪受损肠上皮的修复、肠绒毛的发育,还能够抑制病原菌的粘附、调控肠道菌群。因此,本研究拟构建pEGF重组乳酸菌,以保护断奶仔猪的肠道健康,为现代养猪提供技术支撑。主要研究内容及结果如下:(1)利用乳酸乳球菌NZ3900,nisin诱导型、Lac
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乳酸乳球菌能在肠道内存活,所以常被用做基因工程菌的宿主菌。EGF是一种能够促进表皮细胞增殖与分化的细胞因子。已有研究发现pEGF(猪表皮生长因子)能促进断奶仔猪受损肠上皮的修复、肠绒毛的发育,还能够抑制病原菌的粘附、调控肠道菌群。因此,本研究拟构建pEGF重组乳酸菌,以保护断奶仔猪的肠道健康,为现代养猪提供技术支撑。主要研究内容及结果如下:(1)利用乳酸乳球菌NZ3900,nisin诱导型、Lac F为筛选标记的表达载体pNZ8149构建了pEGF-NZ重组菌,并实现了pEGF的无抗分泌表达。通过western blot检测确定重组乳酸菌pEGF在nisin约为5 ng/m L,诱导20h,可达到最高分泌表达量1.34μg/m L。(2)选择在pEGF蛋白最佳分泌表达条件下培养的重组乳酸菌菌液或其培养上清进行体外,体内功能验证。a.pEGF-NZ重组菌的体外功能验证:检测pEGF-NZ重组菌培养上清对IPEC-J2细胞生长状态及数量影响。与DMEM空白组、空载组相比,重组乳酸菌上清pEGF-NZ-10 ng/m L,pEGF-NZ-20 ng/m L,pEGF-NZ-25 ng/m L,pEGF-NZ-50 ng/m L处理组细胞生长状态较好,细胞数量明显增多;随后通过添加cck8试剂进行细胞数量定量,与空载组、空白组相比,pEGF-NZ-10 ng/m L(p<0.05),pEGF-NZ-20 ng/m L(p<0.05),pEGF-NZ-25 ng/m L(p<0.01),pEGF-NZ-50 ng/m L(p<0.01)处理组OD450值显著升高,且呈剂量正相关。表明重组乳酸菌分泌的pEGF具有促进IPEC-J2细胞增殖的生物功能活性。b.pEGF-NZ重组菌的体内功能验证:在ICR小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌CVCC542前后10d分别灌胃口服pEGF-NZ重组菌菌液或其培养上清,检测pEGF-NZ重组菌菌液或其培养上清对其生长性能、小肠黏膜形态、结肠肠道菌群、血清中细胞因子水平的影响。pEGF-NZ重组菌对小鼠生长性能的影响:与腹泻模型组相比,重组乳酸菌或其培养上清预防组小鼠被毛较密、较光滑,腹泻率降低,但对小鼠日增重无影响。表明重组乳酸菌分泌的pEGF对小鼠肠道有一定的保护作用,但对小鼠促生长作用不明显。pEGF-NZ重组菌对小鼠小肠黏膜形态的影响:腹泻模型组、空载菌液(V-NZ菌液)预防组及空载菌液(V-NZ菌液)治疗组小鼠的十二指肠、空肠、回肠肠绒毛坏死、脱落严重,而pEGF-NZ重组菌液及其培养上清预防组、pEGF-NZ重组菌液及其培养上清治疗组肠绒毛高度较高、较密,且重组乳酸菌治疗组小鼠肠黏膜形态较预防组完整。表明胃内灌注经nisin诱导后的pEGF-NZ重组菌菌液及其培养上清均可促进感染鼠伤寒沙门氏菌小鼠受损肠上皮的修复、肠绒毛的发育,保护肠道健康,且治疗性效果大于预防性效果。通过平板计数法检测pEGF-NZ重组菌对小鼠结肠肠道菌群的影响:与空载组及腹泻模型组相比,pEGF-NZ菌液及其培养上清治疗组显著(p<0.05)降低结肠大肠杆菌数、肠球菌数、鼠伤寒沙门氏菌数,提高乳酸菌的数量。表明pEGF-NZ重组菌分泌的pEGF可抑制病原菌的粘附、上调乳酸菌数,维持肠道菌群的平衡。通过蛋白质芯片检测pEGF-NZ重组菌对小鼠血清型细胞因子的影响:与腹泻模型组相比,pEGF-NZ菌液预防组显著下调(p<0.05)促炎因子IL-1α、IL-1β、IL-4表达,显著(p<0.05)上调抑炎因子IL-13水平;pEGF-NZ菌液治疗组显著(p<0.05)下调促炎因子CCL5、IL-1α表达,显著(p<0.05)上调抑炎因子IL-13表达;pEGF-NZ上清预防组显著(p<0.05)下调促炎因子IL-1α,上调(p>0.05)抑炎因子IL-13表达;pEGF-NZ上清治疗组下调(p>0.05)趋化因子CCL5、IL-1β表达;显著(p<0.05)上调抑炎因子IL-13、IL-10表达。表明pEGF-NZ重组菌分泌的pEGF可通过促进抑炎因子的表达、抑制部分促炎因子的表达发挥抑炎效应。综上所述,本研究中构建的pEGF-NZ重组菌分泌的pEGF能够促进肠上皮细胞增殖、受损肠上皮的修复、肠绒毛的发育,抑制病原菌的粘附,调控肠道菌群、降低腹泻率、抑制炎症的发生。
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