【摘 要】
：
乳酸乳球菌能在肠道内存活,所以常被用做基因工程菌的宿主菌。EGF是一种能够促进表皮细胞增殖与分化的细胞因子。已有研究发现pEGF（猪表皮生长因子）能促进断奶仔猪受损肠上皮的修复、肠绒毛的发育,还能够抑制病原菌的粘附、调控肠道菌群。因此,本研究拟构建pEGF重组乳酸菌,以保护断奶仔猪的肠道健康,为现代养猪提供技术支撑。主要研究内容及结果如下:（1）利用乳酸乳球菌NZ3900,nisin诱导型、Lac
论文部分内容阅读
乳酸乳球菌能在肠道内存活,所以常被用做基因工程菌的宿主菌。EGF是一种能够促进表皮细胞增殖与分化的细胞因子。已有研究发现pEGF（猪表皮生长因子）能促进断奶仔猪受损肠上皮的修复、肠绒毛的发育,还能够抑制病原菌的粘附、调控肠道菌群。因此,本研究拟构建pEGF重组乳酸菌,以保护断奶仔猪的肠道健康,为现代养猪提供技术支撑。主要研究内容及结果如下:（1）利用乳酸乳球菌NZ3900,nisin诱导型、Lac F为筛选标记的表达载体pNZ8149构建了pEGF-NZ重组菌,并实现了pEGF的无抗分泌表达。通过western blot检测确定重组乳酸菌pEGF在nisin约为5 ng/m L,诱导20h,可达到最高分泌表达量1.34μg/m L。（2）选择在pEGF蛋白最佳分泌表达条件下培养的重组乳酸菌菌液或其培养上清进行体外,体内功能验证。a.pEGF-NZ重组菌的体外功能验证:检测pEGF-NZ重组菌培养上清对IPEC-J2细胞生长状态及数量影响。与DMEM空白组、空载组相比,重组乳酸菌上清pEGF-NZ-10 ng/m L,pEGF-NZ-20 ng/m L,pEGF-NZ-25 ng/m L,pEGF-NZ-50 ng/m L处理组细胞生长状态较好,细胞数量明显增多;随后通过添加cck8试剂进行细胞数量定量,与空载组、空白组相比,pEGF-NZ-10 ng/m L（p＜0.05）,pEGF-NZ-20 ng/m L（p＜0.05）,pEGF-NZ-25 ng/m L（p＜0.01）,pEGF-NZ-50 ng/m L（p＜0.01）处理组OD450值显著升高,且呈剂量正相关。表明重组乳酸菌分泌的pEGF具有促进IPEC-J2细胞增殖的生物功能活性。b.pEGF-NZ重组菌的体内功能验证:在ICR小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌CVCC542前后10d分别灌胃口服pEGF-NZ重组菌菌液或其培养上清,检测pEGF-NZ重组菌菌液或其培养上清对其生长性能、小肠黏膜形态、结肠肠道菌群、血清中细胞因子水平的影响。pEGF-NZ重组菌对小鼠生长性能的影响:与腹泻模型组相比,重组乳酸菌或其培养上清预防组小鼠被毛较密、较光滑,腹泻率降低,但对小鼠日增重无影响。表明重组乳酸菌分泌的pEGF对小鼠肠道有一定的保护作用,但对小鼠促生长作用不明显。pEGF-NZ重组菌对小鼠小肠黏膜形态的影响:腹泻模型组、空载菌液（V-NZ菌液）预防组及空载菌液（V-NZ菌液）治疗组小鼠的十二指肠、空肠、回肠肠绒毛坏死、脱落严重,而pEGF-NZ重组菌液及其培养上清预防组、pEGF-NZ重组菌液及其培养上清治疗组肠绒毛高度较高、较密,且重组乳酸菌治疗组小鼠肠黏膜形态较预防组完整。表明胃内灌注经nisin诱导后的pEGF-NZ重组菌菌液及其培养上清均可促进感染鼠伤寒沙门氏菌小鼠受损肠上皮的修复、肠绒毛的发育,保护肠道健康,且治疗性效果大于预防性效果。通过平板计数法检测pEGF-NZ重组菌对小鼠结肠肠道菌群的影响:与空载组及腹泻模型组相比,pEGF-NZ菌液及其培养上清治疗组显著（p＜0.05）降低结肠大肠杆菌数、肠球菌数、鼠伤寒沙门氏菌数,提高乳酸菌的数量。表明pEGF-NZ重组菌分泌的pEGF可抑制病原菌的粘附、上调乳酸菌数,维持肠道菌群的平衡。通过蛋白质芯片检测pEGF-NZ重组菌对小鼠血清型细胞因子的影响:与腹泻模型组相比,pEGF-NZ菌液预防组显著下调（p＜0.05）促炎因子IL-1α、IL-1β、IL-4表达,显著（p＜0.05）上调抑炎因子IL-13水平;pEGF-NZ菌液治疗组显著（p＜0.05）下调促炎因子CCL5、IL-1α表达,显著（p＜0.05）上调抑炎因子IL-13表达;pEGF-NZ上清预防组显著（p＜0.05）下调促炎因子IL-1α,上调（p＞0.05）抑炎因子IL-13表达;pEGF-NZ上清治疗组下调（p＞0.05）趋化因子CCL5、IL-1β表达;显著（p＜0.05）上调抑炎因子IL-13、IL-10表达。表明pEGF-NZ重组菌分泌的pEGF可通过促进抑炎因子的表达、抑制部分促炎因子的表达发挥抑炎效应。综上所述,本研究中构建的pEGF-NZ重组菌分泌的pEGF能够促进肠上皮细胞增殖、受损肠上皮的修复、肠绒毛的发育,抑制病原菌的粘附,调控肠道菌群、降低腹泻率、抑制炎症的发生。
其他文献
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种革兰氏阳性条件致病菌,主要定植于宿主鼻腔内部,在合适的条件下极易感染宿主皮肤或组织,进而引发菌血症等疾病。甲氧西林作为β-内酰胺类抗菌药物自发现之初,主要用于治疗金黄色葡萄球菌感染,1961年首次出现有关甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌报道。近些年发现的金黄色葡萄球菌被认为对很多β-内酰胺类抗菌药物都表现出多重耐药性,因此这类金黄色葡萄
天然免疫是机体抵御外来病原微生物侵袭的第一道防线,模式识别受体（PRRs）与病原相关分子模式（PAMPs）之间的相互作用是激活天然免疫的关键。酮戊二酸脱氢酶（Oxoglutarate Dehydrogenas,OGDH）是α-酮戊二酸脱氢酶复合体的E1组件,位于线粒体基质。α-酮戊二酸脱氢酶是三羧酸循环（TAC）中的第三个调节位点,能够催化α-酮戊二酸脱氢、脱羧,生成琥珀酰辅酶A。线粒体是真核生物
自合成第一种高分子材料以来,高分子材料以其丰富的品种、优异的性能、合适的价格以及其他一些方便的应用,几乎已经渗透到国民经济和人民生活的各个方面。但随着资源短缺与环境问题的不断出现,人们意识到保护环境的重要性,学术界也更加重视环境问题,大力研究和开发可生物降解材料成为解决白色污染等问题迫不及待的需求。聚乳酸（PLA）是一种生物基高分子材料,具有良好的生物相容性、可降解性能以及机械强度而广受关注。然而
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumonia,APP）引起的猪的重要呼吸道传染病,能引起猪的急性死亡,以出血性纤维素性胸膜肺炎和坏死性胸膜肺炎为主要特征,给我国和世界养猪业都造成了重大的经济损失。APP的四种Apx外毒素属于RTX毒素家族,是APP引起宿主组织损伤和急性死亡最重要的毒力因子,具有不同程度的溶血活性和细胞毒性。但关于Apx毒素与宿
补体系统在抵御病原体的入侵、炎症的发生和维持机体动态平衡等方面发挥着重要作用。补体系统主要通过经典途径（CP）、凝集素途径（LP）和替代途径（AP）激活,进而形成机体自我保护的天然屏障。为了能在宿主体内生存繁殖,病原菌进化出了一系列逃逸补体杀伤的机制,这些补体逃逸的机制包括捕获补体调控因子、切割补体组分和产生补体抑制因子等。鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）是一
AlxCoCrFeNi高熵合金具有优异的力学性能、耐腐蚀性能、耐磨性能及热稳定性而被广泛的研究,其制备方法主要为熔炼浇铸和粉末烧结。铸态AlxCoCrFeNi高熵合金的晶粒粗大、烧结态的孔隙较多,因此,降低了其耐磨性。为了提高AlxCoCrFeNi高熵合金的表面耐磨性,采用真空电弧熔炼和放电等离子烧结的方法制备了AlxCoCrFeNi高熵合金基体,再利用激光技术对其表面进行重熔。利用SEM、EDS
近年来,有机-无机卤化物钙钛矿MAPb X3（X=Cl、Br、I）以其低缺陷态密度、高电阻率、低漏电流等优点而成为辐射探测领域的新型潜在材料。但受限于大尺寸、高质量的单晶材料的制备,基于钙钛矿单晶的辐射探测器件性能并不是很理想。对于MAPb Br3晶体,人们发现不同生长条件下晶体的生长机制各有不同,因此对其生长机制还有待深入研究和完善。此外,发现在MAPb X3结构的X位引入双卤素杂化后可获得带隙
难熔高熵合金薄膜作为一种新型功能性薄膜,具有优异的高温抗氧化、抗辐照及抗烧蚀等性能,可作为高温薄膜材料应用于航空航天、核工业与兵器工程等领域。目前,难熔高熵合金薄膜的研究虽然主要以WMoTaNb金属薄膜及其氮化物薄膜的性能为主,但其详细的制备工艺参数和除V以外其他元素的掺杂影响并未有过多涉及。本论文采用磁控溅射方法在Si基体与M2高速钢基体上制备了一系列WMoTaNb系难熔高熵合金薄膜,通过L16
甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）是一类获得mec A基因后以耐β-内酰胺类抗生素为主的多重耐药的金黄色葡萄球菌。MRSA最初根据其流行病学特性被分为了HA-MRSA（医院相关性MRSA）、CA-MRSA（社区相关性MRSA）和LA-MRSA（家畜相关性MRSA）。但近来的研究发现这三类MRSA之间的界限变