【摘 要】
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香草醛是全球应用最广泛的香料之一,常用于食品、化妆品及医药等行业。目前香草醛主要通过化学方法合成,但是该方法存在杂质多、污染严重等问题,通过生物法合成的香草醛在市场上有着巨大潜力。但是由于香草醛化学性质不稳定,对细胞毒性大,在本研究中选择生物合成其前体物香草醇。本研究将香草醇合成途径分为3,4-二羟基苯甲醇合成模块和甲基化模块,并分别进行优化。在合成模块中,通过敲除支路基因、增强莽草酸途径中关键蛋
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香草醛是全球应用最广泛的香料之一,常用于食品、化妆品及医药等行业。目前香草醛主要通过化学方法合成,但是该方法存在杂质多、污染严重等问题,通过生物法合成的香草醛在市场上有着巨大潜力。但是由于香草醛化学性质不稳定,对细胞毒性大,在本研究中选择生物合成其前体物香草醇。本研究将香草醇合成途径分为3,4-二羟基苯甲醇合成模块和甲基化模块,并分别进行优化。在合成模块中,通过敲除支路基因、增强莽草酸途径中关键蛋白表达和筛选3,4-二羟基苯甲醇合成途径,使得前体产量提高两倍;在甲基化模块中,通过构建甲基循环增强甲基供体供应,甲基化能力提高了1.58倍。但是在香草醇单细胞合成中存在中间体大量积累的问题,为此我们采用共培养合成的方法,并在此基础上实施了碳源分离策略。即,上游菌株以甘油为单一碳源,下游菌株以葡萄糖为单一碳源,该策略便于代谢调控和避免菌株之间的碳源竞争。为增加上下游菌株之间的关联,设计构建了生长依赖体系,上游菌株通过敲除莽草酸脱氢酶形成氨基酸缺陷型菌株,该设计不仅进一步提高碳通量,同时增强了共培养系统的稳定性。最终在摇瓶中香草醇的产量达到559.35±14.73 mg/L,与单细胞合成相比提升了2.64倍。在补料分批发酵时通过调节碳源比例实现香草醇的稳定生产,产量达到3890.23±87.89 mg/L。与本课题组的以往研究相比较,提升了16倍,是目前从头合成香草醇的最高产量。这对于香草醛工业化生物合成有一定的指导意义。
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