马动脉炎病毒(equine arthritis virus，EAV)属于动脉炎病毒科，为单股正链RNA病毒，可以引起马的病毒性动脉炎。EAV基因组共编码8个结构蛋白和至少13个非结构蛋白。其中非结构蛋白nsp4是一种典型的3C样丝氨酸蛋白酶，具有切割活性。根据报道，nsp4的三维结构有已知最小的胰凝乳蛋白酶样折叠，还有一个典型的三联体催化中心（Ser-120，His-39和Asp-65）。　　Ⅰ型干扰素是宿主细胞在病毒感染时产生的最主要的抗病毒细胞因子，之前的研究发现EAV可以抑制IFN-β的产生，但具体的作用机制尚不清楚。有文献报道，甲肝病毒和口蹄疫病毒的3C蛋白酶都可以通过其切割活性来抑制IFN-β的产生，那么EAV的3C样蛋白酶即nsp4是否也可以抑制IFN-β的产生呢？　　鉴于此，本论文以EAV nsp4为研究对象，初步探讨了其对IFN-β产生的影响，并进一步解释了其作用机制，主要研究内容如下:　　1.超表达EAV nsp4抑制IFN-β的产生及干扰素刺激基因的表达　　将构建的EAV nsp4的真核表达质粒转染HEK293-T细胞，分别用双荧光素酶报告系统和Real-time PCR检测超表达nsp4对SeV诱导的IFN-β产生的影响，结果表明EAV nsp4在启动子水平和mRNA水平均能够显著抑制IFN-β的产生。我们的研究还发现EAV nsp4可以显著抑制ISG15、ISG20、ISG54和ISG56等多种ISGs的表达。　　2.EAV nsp4通过抑制NF-κB和IRF3信号通路进而抑制IFN-β的产生　　干扰素调节因子3(IRF3)和核转录因子-κB(NF-κB)是调节IFN-β产生的两个重要转录因子，为了阐明EAV nsp4是通过哪个转录因子来抑制IFN-β的产生的，我们利用双荧光素酶报告系统和Western Blot实验检测超表达EAV nsp4对这两个转录因子的影响。双荧光素酶检测结果表明，nsp4可以在启动子水平显著抑制IRF3和NF-κB的活化，并且呈现一定的剂量依赖性;Western Blot结果表明nsp4可以抑制IRF3以及p65的磷酸化。这就说明EAV nsp4是通过抑制IRF3和NF-κB两个转录因子的活性进而抑制IFN-β的产生。　　3.EAV nsp4对IFN-β的抑制依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性　　EAV nsp4是一种典型的3C样丝氨酸蛋白酶。为了探究nsp4对IFN-β的抑制是否与其3C样蛋白酶酶活性是否有关，我们构建了EAV nsp4的3个酶活性位点突变体，即nsp4-H39A，nsp4-D65A和nsp4-S120A。双荧光素酶报告系统检测结果表明，与野生型的EAV nsp4相比，nsp4的酶活性位点突变体对IFN-β的抑制作用明显减弱，这就表明EAV nsp4对IFN-β的抑制依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性。　　4.EAV nsp4通过切割NEMO抑制IFN-β的产生　　RIG-Ⅰ/MDA5信号通路是RNA病毒感染时宿主产生干扰素的一条重要信号通路。为了探究nsp4抑制IFN-β产生的作用靶标，我们将RIG-Ⅰ、MDA5、IPS1和TBK1分别与nsp4共转染HEK293-T细胞，双荧光素酶实验发现EAV nsp4的作用靶标在TBK1的上游，进一步我们又将RIG-Ⅰ、MDA5、IPS1和NEMO分别与nsp4共转染，Western Blot实验发现nsp4可以切割NEMO，而且表现出一定的剂量依赖性。这就表明EAV nsp4是通过切割NEMO来抑制IFN-β的产生。　　5.EAV nsp4对NEMO的切割依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性　　EAV nsp4是一种3C样丝氨酸蛋白酶，具有切割活性，因此我们想探究nsp4对NEMO的切割是否依赖其3C样蛋白酶活性，所以将NEMO分别与野生型的nsp4及其酶活性位点突变体共转染，结果发现nsp4的酶活性位点突变体不能切割NEMO，而野生型的nsp4可以切割NEMO，这就说明nsp4对NEMO的切割依赖其3C样丝氨酸蛋白酶活性。