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目的:利用蛋白质芯片技术鉴定人类乳腺癌进展中的关键因子.运用人类细胞抗体芯片技术分析11株人类乳腺癌细胞的细胞因子表达谱,并进一步研究细胞因子在乳腺癌进展中的作用机制.研究内容和方法:研究材料包括11种乳腺癌细胞株:MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB-468、SKBr-3、BT-20、BT-474、BT-549、T47D、ZR75-1、Hs587T、MCF-7细胞株以及35种细胞因子.第一部分蛋白质芯片技术分析乳腺癌细胞的细胞因子表达谱.开始实验前收集细胞培养上清液.将培养细胞用磷酸盐缓冲液洗涤,以0.25％胰酶/EDTA消化后,按1×10<6>个细胞/盘密度培养于100mm的细胞培养盘内.细胞首先在8ml含有10%FCS的DMEM培养液中增殖48小时,PBS洗涤细胞两次,更换8ml含有0.2%牛血清的DMEM培养液.48小时后,收集细胞上清液,离心1000g去除细胞碎片,分装并储存于一80℃,直至进一步的实验.同时,收集细胞并测定蛋白质浓度,实验时根据细胞蛋白质浓度标化细胞上清液.第二部分IL-8在乳腺癌细胞侵袭、血管生成和增殖中的作用.乳腺癌细胞体外侵袭能力的测定在重建基底膜的12孔板Transwell小室中进行.Matrigel 30μl用不含血清的DMEM培养基1:1稀释(总量60μl),加入Transwell小室的多孔聚碳酯膜上表面(膜孔径12.0 μm),室温下通风橱中干燥1小时.将不同细胞株的细胞用PBS洗3次,消化后重悬于含10%FCS的DMEM培养基中,取4×10<5>/ml细胞0.5ml加入至上室,1.5ml 10%FCS的DMEM培养基加入下室.37℃、5%C0<,2>条件下培养24小时,4%甲醇固定后行Gimsa染色.去除滤膜上层细胞,显微镜下(×320)计数滤膜下表面的侵袭了基底膜的细胞数,随机计数5个视野中的细胞数目,以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力.第三部分ER对乳腺癌细胞IL-8的表达调控研究.利用细胞上清液芯片实验检测MDA-MB-231细胞和ER-α转染的MDA-MB-231细胞IL-8的表达差异.4℃下将40μg/ml的抗IL-8抗体包被hybond ECL膜4小时,室温干燥.接着,将0.2μ1不同来源的细胞上清点样于膜上.细胞上清液膜在5%BSA/TBS中封闭非特异性位点1小时后,与生物素标记的抗IL-8抗体混合液孵育1.5小时.经过3次0.1%Tween20/TBS和2次TBS震荡洗涤,最后将芯片膜与2.5ng/ml HRP-Streptavidin孵育1小时.同样的洗涤条件去除未结合的HRP-Streptavidin.ECL法显示信号.β-雌二醇实验是在MDA-MB-231原代细胞和S30培养基中加入2nM β-雌二醇,收集细胞上清液并进行细胞上清液芯片实验.采用FuGENE 6转染法将ER-α及IL-8启动子pN1481 Luc或p Luc0转染至人类乳腺癌细胞,同时共转染HSV-TK表达质粒pRL-TK作为测定转染效率的内参对照.双荧光素酶报告基因检测ER-α对IL-8启动子的调控作用.结论:1.人类乳腺癌细胞所分泌的IL-8在乳腺癌细胞侵袭过程中具有重要作用.2.人类乳腺癌细胞所分泌的IL-8能刺激体内外的血管生成.3.人类乳腺癌细胞所分泌的IL-8不影响乳腺癌细胞增殖.4.ER-α下调人类乳腺癌细胞的IL-8表达.5.蛋白质芯片有望成为肿瘤进展研究的重要手段.6.细胞因子可能是人类乳腺癌进展中重要的靶因子.