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寄主植物感染病毒,会呈现发病症状,这些症状表型多与病毒的致病因子密切相关。病毒编码的致病蛋白又往往与寄主植物体内的相关蛋白因子相互作用,从而调控寄主植物的新陈代谢和生长发育。研究证明,草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)编码的P6蛋白是一个症状决定子,在病毒侵染草莓的过程中起关键作用,但目前尚不明确其具体分子致病机制。本课题开展了P6蛋白的相关致病功能研究,并且利用转录组测序技术(RNA-Seq)全面了解病毒侵染草莓后各基因的表达差异,进一步验证差异基因的功能,为在分子水平上阐述SVBV的致病机制奠定了基础。1.瞬时浸润验证SVBV P6及其突变体对症状表型的影响含pGR-P6, pGR-AP6和空载体pGR106的农杆菌分别浸润本氏烟,pGR-P6和pGR-△P6浸润的表型相似,系统叶均表现重度花叶症状,而空载体pGR106浸润,仅表现轻花叶症状。ELISA检测P6和△P6是否在本氏烟中表达,结果表明,pGR-P6能表达P6蛋白,而pGR-△P6不能表达P6蛋白。为了进一步确定△P6蛋白的表达情况,构建重组表达载体pGR-P6-GFP和pGR-△P6-GFP,瞬时浸润本氏烟,结果发现,pGR-P6-GFP浸润的本氏烟叶片出现绿色荧光,而pGR-△P6-GFP浸润的本氏烟叶片无绿色荧光出现,说明P6能够正常翻译下游GFP,而△P6不能正常翻译。结果表明,SVBV P6可能在RNA水平上影响植株的症状表型。2. SVBV P6对PVX的复制及对GFP表达的影响pGR-P6、pGR-△P6和空载体pGR106分别浸润本氏烟叶片,Northern blot和qRT-PCR检测系统叶中PVX RNA的积累水平。结果发现,接种pGR-P6、 pGR-△P6和pGR106的本氏烟系统叶中,PVX RNA的积累水平差异不显著,说明P6和AP6对PVX的复制水平均没有影响。pBIN-P19、pCAM-P6、pCAM-△P6和空载体pCAM2300分别与pCAM-GFP共浸润本氏烟叶片,Northern blot和Westhern blot分别检测GFP在RNA水平和蛋白水平上的表达量。结果发现,pCAM-P6和pCAM-GFP共浸润,GFP的表达量显著提高；pCAM-△P6和pCAM-GFP共浸润,GFP表达量与阴性对照相比差异不显著,说明P6蛋白能够促进GFP的表达。3. SVBV P6及其突变体蛋白的亚细胞定位pCAM-P6-GFP瞬时浸润本氏烟叶片,融合蛋白P6-GFP的荧光主要分布在细胞核上。说明P6蛋白具有核定位功能。生物信息学分析表明,P6蛋白的192-223aa和402-426aa可能是核定位功能域。构建重组表达载体pCAM-P6(△ 192-223aa)-GFP和pC AM-P6(△402-426aa)-GFP,分别瞬时浸润本氏烟叶片。结果发现,P6和P6(△192-223aa)均定位于细胞核中,而P6(△402-426aa)主要分布于细胞轮廓上,说明P6蛋白402-426 aa可能是P6的核定位信号区域。这一区域可能与P6的致病相关。4. SVBV P6蛋白与SVBV编码其他蛋白间的互作双分子荧光互补验证SVBVP6蛋白与SVBV编码其他蛋白间互作。YFPn-P6分别与YFPc-P2和YFPc-P4共浸润,YFPc-P6分别与YFPn-P2, YFPn-P4共浸润。结果发现,各处理组均无黄色荧光,说明P6与P2和P4均不能互作。进一步验证P6和P4蛋白的自身互作,YFPn-P6与YFPc-P6及YFPn-P4与YFPc-P4共浸润,结果发现,P4蛋白自身能够互作,有明显的黄色荧光出现,P6蛋白自身不能互作,无黄色荧光。酵母双杂交验证SVBVP6蛋白与P4蛋白的互作。处理组AD-P6与BK-P4、 BK-P6与AD-P4、 AD-P6与BK-P6及AD-P4与BK-P4分别共转化酵母,结果发现,仅AD-P4与BK-P4共转化酵母能长出白色酵母菌落,说明P6蛋白与P4蛋白不能互作,P6蛋白自身不能互作,而P4蛋白自身互作。5.感染SVBV的森林草莓和健康森林草莓转录组的差异表达利用新一代测序技术(RNA-Seq),构建了感染SVBV的森林草莓以及健康森林草莓的文库,比较了感病森林草莓与健康森林草莓基因表达的差异。转录组测序共得到36850个不同的Unigene,其中517个基因为差异表达基因。通过生物信息学预测发现,涉及牛磺酸代谢、植物病原互作等途径在SVBV侵染森林草莓中起重要作用。研究结果首次阐述了SVBV与寄主草莓之间的基因互作关系,为研究SVBV侵染森林草莓的致病机理奠定了基础。6.P6与草莓宿主基因MYB12的互作关系转录组(RNA-Seq)分析结果表明,SVBV侵染森林草莓后MYB12基因大量表达。本研究从草莓镶脉病毒(SVBV)侵染的森林草莓植株中分离出转录因子MYB12基因。qRT-PCR结果表明,SVBV侵染森林草莓后MYB12基因积累水平显著提高,是健康草莓的5倍以上。双分子荧光互补(BIFC)实验结果发现,P6不与MYB发生直接互作,表明,SVBV侵染森林草莓后MYB12基因的大量表达,不是由于P6与MYB发生互作引起的。