栖息于潮间带的海洋无脊椎动物具有多种生物节律以适应环境的变化,如:昼夜节律、潮汐节律和月节律等,这些生物节律都与神经系统的可塑性调节密不可分。海洋无脊椎动物的神经系统的结构比高等脊椎动物相比较简单,是研究神经系统相关功能的良好材料。栖息于潮间带的海洋无脊椎动物瘤背石磺广泛分布于我国东南部沿海地区,易于获得且神经系统结构非常简单,是研究神经系统的可塑性调节的良好材料,可发展成为一种优良的海洋软体动物模型。本实验室前期已经鉴定出我国沿海地区主要有4种石磺,其中瘤背石磺神经系统结构简单,为研究其如何感知潮汐节律的机制提供了便利,同时也是研究潮间带海洋动物生物节律的良好材料。本实验主要通过瘤背石磺神经节部位Ca²⁺信号通路相关基因的克隆表达分析,Western blot对Or Ca MKII蛋白的定位分析和低频声波频率模拟潮汐对瘤背石磺神经可塑性调节初步的探索。1.Or Ca M,Or Ca MKII和Or Ca MKIV基因的克隆和组织表达分析Ca²⁺信号通路是节律性调节的重要通路之一,具有神经可塑性调节的功能。当机体受到环境胁迫、病毒入侵和机械损伤等外界因素的刺激时,内流的Ca²⁺与Ca M结合形成Ca²⁺/Ca M复合物后被激活,从而激活下游基因Ca MK发生磷酸化,接着CREB被激活,引起相应的生理行为的改变。为了探究瘤背石磺由海洋向陆地进化过程中Ca²⁺信号通路机制调节的作用,进一步理解该信号通路在瘤背石磺神经调节中发挥的生理功能奠定基础。本实验以瘤背石磺神经节为实验材料,利用RACE-PCR技术克隆到Ca M、Ca MKII和Ca MKIV基因的c DNA序列,并进行生物信息学分析和q RT-PCR实验。结果显示,Or Ca M基因的c DNA全长2 123 bp,开放阅读框为465 bp,共编码155个氨基酸,具有4个Eh-hand结构域。预测该基因编码的多肽链的原子数量是2 387,分子量约为17 421 k Da,理论等电点4.03,分子式为C₇₄₂H₁₁₇₀N₂₀₀O₂₆₇S₈。Or Ca MKII基因的c DNA全长1 656 bp,开放阅读框为1 347 bp,共编码449个氨基酸,具有S＿TKc结构域;预测该基因编码的多肽链的原子数量是7 178,分子量约为50.853 k Da,理论等电点7.24,分子式为C₂₂₇₇H₃₅₉₃N₆₂₉O₆₆₆S₁₃,N端信号肽由1～29个氨基酸组成。Or Ca MKIV基因的c DNA全长1 603 bp,开放阅读框为1 032 bp,共编码343个氨基酸,具有S＿TKc结构域;预测该基因编码的多肽链的原子数量是5 490,分子量约为3.873 7 ku,理论等电点6.12,分子式为C₁₇₄₁H₂₇₆₈N₄₅₂O₅₁₄S₁₅,N端信号肽由1～29个氨基酸组成。荧光定量PCR检测Or Ca M-Or Ca MKII-CREB1基因在不同的组织分布情况,结果显示,Or Ca M-Or Ca MKII-CREB1基因在各个组织均有表达,其中在神经节的相对表达量最高,其次在肠组织的相对表达量较高。而q RT-PCR检测Ca MKIV基因在组织中分布情况分析结果显示Ca MKIV基因在各个组织均有表达,其中在腹足的相对表达量最高,其次是背部皮肤、口器,而在神经组织、蛋白腺、肠、肝胰腺等脏器组织的相对表达量较低,初步推测这些基因可能参与瘤背石磺神经系统的可塑性调节。2.潮汐节律和昼夜节律对瘤背石磺Ca²⁺信号通路相关基因表达的影响栖息于潮间带的海洋动物长期暴露于涨潮和退潮的环境中,其行为和生理状态很大程度上受到太阳和月亮所引起的潮汐周期的影响。瘤背石磺暴露于潮汐周期运动的环境中,根据2019年5月15-20日的潮汐表,选择潮汐最低潮的样品,涨潮和退潮的取样点是在潮水在300 cm和350 cm之间,因为当潮水位于最高潮时瘤背石磺被潮水所淹没,无法取样。当潮水在300 cm和350 cm之间时,海水正好接触样品。根据每天的取样时间往后延迟大约60 min,连续6天取样。q RT-PCR检测Or Ca M-Or Ca MKII-CREB1基因在连续6天潮汐和昼夜环境下在神经节中表达分析,结果显示Or Ca M-Or Ca MKII-CREB1基因在夜晚最低潮时的表达量高于其他实验组（P<0.05）。Western blot检测第二天中Or Ca MKII蛋白在潮汐和昼夜环境下在神经节的定位分析,结果显示瘤背石磺暴露于最低潮时神经节Ca MKII蛋白的表达较高。我们猜测这些基因在潮汐和昼夜环境作用下的表达可能与受潮汐节律和昼夜节律的调节有关。3.潮汐低频声波频率对瘤背石磺Ca M-like、Ca MKII基因的表达及功能研究在实验室内模拟潮汐中低频声音刺激瘤背石磺,通过RACE-PCR技术克隆到Ca M-like基因的c DNA序列,并进行生物信息学分析和q RT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺Ca M-like基因的c DNA全长2 321bp,618 bp的开放阅读框编码206氨基酸,具有一个Eh-hand结构域;预测该基因编码的多肽链的原子数量是3 165,分子量约为23 029.64 KDa,理论等电点4.64,分子式是C₁₀₁₈H₁₅₄₄N₂₇₄O₃₂₀S₉。N端信号肽由29个氨基酸组成。氨基酸序列比对构建系统进化树,结果显示瘤背石磺Ca M-like基因与静水椎实螺、光滑双脐螺的Ca M-like基因的亲缘关系最接近,这与传统形态学的分类相吻合。q RT-PCR检测Ca M-like基因在不同组织的分布情况,结果显示Ca M-like m RNA在瘤背石磺不同组织均有表达,但神经节部位的表达量显著高于其它组织（P<0.05）,推测其可能参与神经系统的可塑性调节。荧光定量结果显示Ca M-like、Ca MKII基因分别在25 HZ和50 HZ低频声波频率12.4 h刺激下表达量较高,初步推测其能感知25 HZ-50 HZ声波频率。这可能与瘤背石磺栖息于潮间带中长期感知12.4 h潮汐周期节律,与潮汐节律有关。4.致病细菌对瘤背石磺新型C-型凝集素、血淋巴和超氧化物歧化酶/碱性磷酸酶活性的影响海洋环境中的细菌感染是一个严重的问题对维持海洋生态系统稳定性。然而,到目前为止,关于沿海生态系统中病原细菌的生物学影响的报道甚少。因此,我们研究了无壳贝类瘤背石磺抵抗病原性细菌感染的反应。这里的数据分析可以用作评估瘤背石磺固有免疫反应的基础信息。克隆了Or CTL c DNA的全长,其编码共192个氨基酸的1849个碱基对（bp）组成。构建氨基酸序列多重比对表明Or CTL具有保守的CTL碳水化合物识别结构域（CRD）,其中包含EPS（Glu-Pro-Ser）基序,可能揭示了其与他无脊椎动物一样对碳水化合物的有识别功能。Or CTL m RNAs主要表达于在神经节和肝胰腺等组织中;Or CTL m RNAs表达量在哈维氏弧菌感染后2 h后开始表达上调,在4 h迅速下降,在12 h明显增加。此外,用副溶血弧菌感染后,Or CTL基因表达从2 h开始略微上调,在12 h达到峰值。另外,我们研究了酶活性（在肝胰腺中）和细胞免疫（在血淋巴中）以及超氧化物歧化酶（SOD）活性,碱性磷酸酶（ALP）活性和细胞周期。哈维氏弧菌和副溶血弧菌感染后,SOD活性分别显著高于对照组。相反,用细菌感染后,ALP活性分别比对照组明显受到抑制。肝胰腺中的酶活性波动明显,并且细菌对ALP活性更敏感。血淋巴细胞周期结果显示,在细菌感染后,血淋巴中S和G2/M期的细胞百分比明显较高。我们的研究结果表明,病原菌可以激活瘤背石磺的免疫反应,这将为研究水生动物在疾病预防中提供参考依据。