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【背景和目的】微粒体前列腺素E2合成酶1(microsomal Prostaglandin E Synthase 1,mPGES1)是合成前列腺素E2(Postaglandin E2,PGE2)所需关键限速酶之一,不仅参与炎症过程,还可影响肝癌的发生发展、侵袭转移及复发。mPGES1在多种肿瘤细胞表面呈高表达,而在正常组织细胞表面呈极低表达或不表达的状态,可视为肿瘤相关抗原(Tumor-associated Antigen,TAA),也是肝癌预防及治疗的有效分子靶点。肿瘤疫苗中的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)表位疫苗,尤其是利用树突状细胞(Dendritic Cell,DC)负载CTL表位制备的DC疫苗,被认为是新一代肿瘤免疫治疗策略中前景较好的治疗方式之一。为了设计及合成人mPGES1的CTL表位广谱多抗原肽(Multiple Antigen Peptide,MAP)并检测其体外抗肝癌活性,本课题筛选人mPGES1的HLA-A2/A3限制性CTL表位,设计并合成以聚赖氨酸为核心的四分支树状结构MAP,分离培养小鼠骨髓来源DC以负载MAP合成疫苗,观察其对肝癌细胞的体外杀伤作用。【方法】(1)SYFPEITHI预测获取mPGES1的HLA-A2/A3限制性CTL表位,筛选出与HLA-A2和HLA-A3两种基因型均有较高预测分值的九肽;MHCPred预测工具分析所选九肽与HLA的结合能力,分值大于5.0被认为具有结构亲和性。(2)标准固相肽合成法(SPPS)合成3种以聚赖氨酸为核心组成紧密有序的四分支树状结构MAP,即(VSRIPARLK)4、(LRVQGTIIA)4、(VTHAVRGVL)4(以下简称M1、M2、M3);合成1种普通单链结构MAP即VSRIPARLK(以下简称M5)。(3)反相高压液相色谱仪(RP-HPLC)分析鉴定MAP的纯度情况;液相色谱/质谱联用(LC/MS)检测MAP分子量与理论值的差异。(4)小鼠骨髓来源DC分离和培养至成熟;倒置荧光显微镜下观察细胞形态;扫描电子显微镜下观察表面结构;流式细胞仪鉴定细胞表面分子标志物CD83、CD86及CD11c的表达情况。(5)小鼠脾淋巴细胞分离和培养;各MAP与成熟小鼠DC共孵后,再与小鼠脾淋巴细胞共培养以诱导mPGES1特异性CTL增殖作为效应细胞。培养人肝癌细胞株HepG2、Huh-7、MHCC97h及SMMC7721,Western Blot检测各细胞株mPGES1表达情况,筛选出高、中、低水平表达mPGES1的3株作为靶细胞。(6)按照1:3、1:1、3:1、10:1、25:1、50:1设定效-靶比(Effector Cells:Target Cells Ratio,E:T Ratio),分组进行杀伤实验:(1)负载M1的小鼠DC及淋巴细胞,记为M1组;(2)负载M2的小鼠DC及淋巴细胞,记为M2组;(3)负载M3的小鼠DC及淋巴细胞,记为M3组;(4)同时负载M1、M2、M3三种四分支MAP的小鼠DC及淋巴细胞,记为M4组;(5)负载单链肽M5的小鼠DC及淋巴细胞,记为M5组;(5)无MAP负载的小鼠DC及淋巴细胞,记为M0组。另设不加任何免疫细胞的人肝癌细胞为Control组。(7)CCK-8法检测效应细胞的毒性作用;在效-靶比为10:1的条件下,Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞仪检测靶细胞的凋亡情况;在效-靶比为25:1的条件下,ELISA法检测细胞上清液中小鼠细胞因子IFN-γ的分泌水平。【结果】(1)获取mPGES1的HLA-A2/A3限制性CTL表位,合成四分支树状结构MAP和单链结构MAP;各MAP的纯度均高于95%,符合国际多肽的实验标准;MAP的分子量分别为4495.00 kDa、4215.60 kDa、4140.00 kDa和1040.20 kDa,与理论值无明显差异。(2)分离和培养小鼠骨髓来源DC至成熟,光镜下见特殊的树枝状突起形态,电镜下见典型的网纱状、突起状表面结构,符合DC形态特征;细胞表面分子标志物CD83、CD86、CD11c表达水平较高,分别为89.61%、89.74%、95.16%,均符合DC表型特征。(3)分离和培养小鼠脾淋巴细胞,与负载MAP的成熟小鼠DC共孵后获得效应细胞;培养高表达mPGES1的MHCC97h、中等表达的Huh-7、低表达的HepG2人肝癌细胞作为靶细胞。(4)设定1:3、1:1、3:1、10:1、25:1、50:1为效-靶比,CCK-8法检测结果显示:随效应细胞浓度上升或随效-靶比增大,效应细胞对靶细胞的毒性作用越强;当杀伤同一种靶细胞且效-靶比相同时,M1组、M2组、M3组和M4组效应细胞对靶细胞产生的毒性作用均较M5组和M0组明显增强(p<0.05);当使用同一种效应细胞进行杀伤时,效应细胞对靶细胞产生的毒性作用在MHCC97h中最强,依次为MHCC97h、Huh-7、HepG2(p<0.05)。(5)设定10:1为效-靶比,Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞仪检测结果显示:当杀伤同一种靶细胞时,凋亡效应在M3组或M4组中最明显,依次为M3组或M4组、M1组或M2组、M5组或M0组(p<0.05),其中M3组和M4组之间未见明显差异、M1组和M2组之间未见明显差异、M5组和M0组之间未见明显差异(p>0.05);当使用同一种效应细胞进行杀伤时,凋亡效应在MHCC97h中最明显,依次为MHCC97h、Huh-7、HepG2(p<0.05)。(6)设定25:1为效-靶比,ELISA法检测结果显示:当杀伤同一种靶细胞时,小鼠细胞因子IFN-γ分泌水平在M3组或M4组中最高,依次为M3组或M4组、M1组或M2组、M5组或M0组(p<0.05),其中M3组和M4组之间无明显差异、M1组和M2组之间无明显差异、M5组和M0组之间无明显差异(p>0.05);当使用同一种效应细胞进行杀伤时,小鼠细胞因子IFN-γ分泌水平在MHCC97h中最高,依次为MHCC97h、Huh-7、HepG2(p<0.05)。【结论】(1)成功合成人mPGES1的HLA-A2/A3限制性CTL表位广谱MAP。(2)成功分离、获取小鼠骨髓来源DC并培养至成熟,其表面结构及分子表型均符合成熟DC特征。(3)负载人mPGES1的CTL表位四分支MAP的小鼠DC疫苗可通过分泌细胞因子IFN-γ在体外特异性杀伤人肝癌细胞,杀伤效率与细胞mPGES1表达水平呈正比;其抗肝癌效应较单链结构MAP强,且与CTL优势表位VTHAVRGVL有关,而与CTL表位数量无关。