论文部分内容阅读
目的建立2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)体外染毒模型,观察线粒体膜电位变化和细胞内ROS等氧化损伤指标的活力,WB法检测细胞中Bax、Bcl-2、CytC、Caspase3、Caspase9蛋白表达,验证2,4-D可能通过线粒体途径诱导PC12细胞凋亡的作用机制及枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)的调节作用,为2,4-D致神经系统损伤的可能机制提供依据。方法体外培养PC12细胞,绘制细胞生长曲线并采用CCK-8法确定2,4-D和LBP浓度,实验分:空白对照组、2,4-D染毒组(剂量分别为400、800、1200μmol/L)、干预组(1200μmol/L2,4-D+250 mg/L LBP)分别染毒24h后,收集细胞进行试验。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,透射电镜观察细胞线粒体超微结构变化和凋亡小体,2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)法测定PC12细胞中的ROS水平,微量酶标法测定细胞内MDA含量、SOD、GSH-Px活力,Hochest33258染色定性检测细胞凋亡情况,流式细胞仪定量检测细胞凋亡率,JC-1法测定线粒体膜电位变化,免疫印迹法(Western blot)检测细胞中蛋白Bax、Bcl-2、CytC、Caspase3、Caspase9含量的变化。结果1.常规培养PC12细胞后测其生长曲线发现:在24 h内细胞增殖速度较慢。在24-48 h细胞增殖进入对数生长期而且细胞在正常状态下凋亡数量较少。在48-84 h内细胞数处于大量增长阶段,死细胞数量也在增加。84-108h内细胞总数量不再增长,活细胞数量下降,死细胞数量增加。2.与对照组相比,各浓度2,4-D染毒组细胞的存活率均降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与2,4-D高剂量组相比,LBP干预组细胞的存活率升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.倒置相差显微镜下观察,与对照组相比,各浓度2,4-D染毒组细胞逐渐出现形态固缩、变圆、边缘模糊、突触变短或消失、细胞间隙增大、表面光滑;与2,4-D高剂量组相比,LBP干预组细胞数量较多,损伤程度较轻。4.透射电镜下观察,与对照组相比,各浓度2,4-D染毒组出现细胞线粒体结构的损伤,主要表现为线粒体肿胀,数量减少,后期出现凋亡小体;与2,4-D高剂量组相比,LBP干预组细胞器较完好,线粒体清晰可见。5.与对照组相比,各浓度2,4-D染毒组细胞内ROS水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与2,4-D高剂量组相比,LBP干预组细胞内ROS水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.与对照组相比,各浓度2,4-D染毒组细胞的MDA含量均升高、SOD和GSH-PX活力降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与2,4-D高剂量组相比,LBP干预组细胞MDA含量降低、SOD和GSH-Px活力升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.倒置荧光显微镜下观察,与对照组相比,各浓度2,4-D染毒组细胞核固缩浓染,发出较强蓝色荧光,呈凋亡特征性形态;与2,4-D高剂量组相比,LBP干预组细胞核均匀淡染,发蓝色荧光,细胞界限清晰。8.与对照组相比,各浓度2,4-D染毒组细胞的凋亡率升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与2,4-D高剂量组相比,LBP干预组细胞凋亡率降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。9.与对照组相比,各浓度2,4-D染毒组细胞的线粒体膜电位均降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与2,4-D高剂量组相比,LBP干预组细胞的线粒体膜电位升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。10.与对照组相比,各浓度2,4-D染毒组蛋白Bax、Caspase9、Caspase3、Cyt-C表达量增加,Bcl-2表达量下降,Bcl-2/Bax比值下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与2,4-D高剂量组相比,LBP干预组蛋白Bax、Caspase9、Caspase3、Cyt-C表达量下降,Bcl-2表达量增加,Bcl-2/Bax比值升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论2,4-D能够抑制PC12细胞增殖活性,破坏线粒体超微结构,降低线粒体膜电位,引起细胞内ROS水平升高,细胞核固缩浓染,发出较强蓝色荧光,呈凋亡特征性形态,引起Bax、CytC、Caspase3、Caspase9蛋白表达量增加,Bcl-2表达量降低,2,4-D可通过线粒体途径诱导细胞凋亡,LBP对2,4-D诱导的细胞凋亡具有调节作用。