【摘 要】
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目的:糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的并发症之一,主要表现为多发性、对称性末端神经病变,其发病机制尚不明确。中医药在这一领域的研究越来越受到关注,本研究旨在探讨中
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目的:糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的并发症之一,主要表现为多发性、对称性末端神经病变,其发病机制尚不明确。中医药在这一领域的研究越来越受到关注,本研究旨在探讨中药葛根的提取物葛根素对高糖诱导的雪旺细胞凋亡的保护作用及其可能机制。方法:观察RSC96雪旺细胞的形态并用免疫细胞化学和PCR方法对其进行鉴定;取第3-5代RSC96雪旺细胞,进行MTT实验,分组如下:空白对照组(只含有正常培养基,没有细胞),正常组(正常培养基+细胞),模型组(200 m M高糖+1640培养基,培养24 h),葛根素干预组(浓度为0.01、0.1、1 m M的葛根素+1640培养基,干预3 h),每组设置5个复孔,实验重复3次;用JC-1染色法观察细胞内线粒体膜电位的变化;采用免疫细胞化学方法测定细胞中NGF蛋白的表达;Western Blot法检测细胞中NGF、caspase-3和AKt、p AKt蛋白的表达。结果:本实验中所用的RSC96雪旺细胞经培养后,细胞生长状态及增殖情况良好,细胞呈现长梭形,有极状突起,经免疫细胞化学和PCR方法鉴定后,细胞内S-100的表达为阳性,定位准确。MTT实验结果显示:雪旺细胞培养的第24-72 h生长旺盛,72 h后减缓;与control组相比,高糖模型组中细胞的增殖率明显下降,有统计学意义(P<0.05);与高糖组相比,葛根素各组中细胞的增殖率均高于模型组,并呈现出浓度依赖,有统计学意义(P<0.05)。JC-1染色结果:正常雪旺细胞呈现橙色荧光,细胞出现凋亡时则逐渐转为绿色荧光。与control组相比,高糖模型组中的细胞数明显减少,且细胞胞质多呈现绿色荧光;与模型组相比,葛根素干预组中,随浓度的增加,其细胞所呈现的绿色荧光逐渐减少,而橙色荧不断增多。免疫细胞化学结果:与正常组相比,模型组中NGF蛋白阳性表达较正常组显著下降(P<0.01);与模型组相比,经葛根素预保护处理后,NGF蛋白阳性表达情况有所逆转(P<0.05);而葛根素的各浓度组之间无统计学差异(P>0.05)。Western Blot结果:与正常组相比,模型组中NGF蛋白的表达量明显减少(P<0.05);与模型组相比,葛根素干预组中NGF蛋白的表达量升高,尤其是葛根素高浓度组(1 m M)差异显著(P<0.01)。与正常组相比,模型组中caspase-3蛋白的表达量显著增加(P<0.05);而与模型组相比,葛根素干预组中caspase-3蛋白的表达量明显减少,以高浓度组(1mM)呈现显著差异(P<0.01)。与正常组相比,经浓度为200 m M的高糖处理后,pAkt蛋白的表达降低,差异有显著性(P<0.05);用1 mM的葛根素干预后,pAkt蛋白的表达较高糖组增高(P<0.01),而在PI3K抑制剂LY2940002处理组,pAkt蛋白的表达情况较葛根素组有所逆转。结论:高糖能明显抑制雪旺细胞的增殖,且与葡萄糖的浓度呈负相关;葛根素能够抑制高糖诱导的雪旺细胞凋亡,促进RSC96细胞中NGF蛋白的表达,抑制caspase-3的酶活性;葛根素能够促进高糖环境下RSC96细胞内Akt的磷酸化,且这种作用可被P13K的抑制剂LY294002所阻断,说明葛根素在此发挥作用的可能机制是通过激活PI3K/AKt信号通路而实现的。
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