[前 言]结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是世界上第四大致命癌症。手术治疗是目前治疗CRC的主要手段,更是根治CRC的唯一选择,但大部分患者在诊断明确,拟行手术治疗时已出现肿瘤侵犯大血管或已存在远处转移的情况,而失去手术机会,其5年生存率长期维持在10%左右。因此,明确CRC高侵袭转移生物学特征的内在机制对提高CRC患者生存率具有重要意义。中性粒细胞主要浸润于肿瘤上皮细胞,既往大量研究表明,在癌变组织中存在大量的肿瘤相关中性粒细胞（Tumor-Associated Neutrophils,TANs）,并且大量的中性粒细胞浸润与癌症患者的不良预后有关,肿瘤分泌的转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）倾向于促进 TANs 向 N2 表型分化,而N2中性粒细胞的浸润被认为与肿瘤的转移扩散有关。但N2中性粒细胞对CRC恶性表型的影响仍知之甚少。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是可逆的细胞程序,使极化的上皮细胞向间质细胞转化,促进细胞移动。EMT通过促进原肠原体形成、神经嵴分层和多种细胞以及组织类型的产生,是胚胎发育、组织修复和疾病中的重要细胞机制。EMT在器官纤维化和癌症等病理条件下异常激活。在肿瘤中,癌细胞利用EMT促进其与原发肿瘤分离并扩散到血液中,获得肿瘤转移进展的侵袭表型,再次通过间质上皮转化定植于转移灶。外泌体（Exosomes）是细胞内溶酶体微粒内陷形成的小脂质双层膜囊泡,因其能够直接参与细胞间信息的传递和物质的运输,被认为是细胞间通讯、免疫调节、疾病诊断和预后循环生物学标志物的重要载体。越来越多的证据表明,肿瘤相关免疫细胞释放的外泌体可促进肿瘤的生长及转移。但目前对尚缺乏N2中性粒细胞来源的外泌体对恶性肿瘤表型影响机制的研究。微小核糖核酸（microRNAs,miRNA）是一类内源性无编码功能的小分子单链RNA,仅有20-25个核苷酸,最早发现于秀丽隐杆线虫,其可在核糖核酸诱导沉默复合物内,通过其5’-UTR的种子序列与靶mRNA 3’-UTR识别元件之间的碱基配对来调节靶基因的稳定性和/或翻译。研究显示,miRNA在包括细胞分化、发育、转移以及和肿瘤形成等生理和病理过程中发挥关键作用。研究已经证实,在肿瘤的发生与发展过程中存在miRNA异常表达,miRNA通过促进或抑制癌细胞的EMT过程,参与调控肿瘤进程。但是,随着对肿瘤微环境（Tumor Micro Environment,TME）研究的逐渐深入,肿瘤相关免疫细胞,尤其是肿瘤相关中性粒细胞,是否能通过外泌体影响肿瘤恶性生物学行为,以及其具体的分子机制成为了新的研究方向。[目 的]本研究并通过比较CRC患者CRC组织内中性粒细胞浸润程度的差异,探讨中性粒细胞浸润与CRC转移间的内在关系。研究N2中性粒细胞外泌体中miR-4780对CRC恶性生物学行为的影响,并验证其与SOX11的靶向关系及调控作用。[方法]本研究选取在昆明医科大学第一附属医院2019年1月-2019年10月住院30例36-82岁的CRC患者作为研究对象;所有参与者均获取知情同意并签字。利用癌症成像档案（The Cancer Imaging Archive,TCIA）数据库分析CRC患者TME中不同免疫细胞的浸润情况,并通过比较临床标本中中性粒细胞浸润程度的差异,探讨中性粒细胞浸润与CRC转移间的内在关系。依次利用全反式维甲酸以及TGF-β诱导人骨髓性白血病细胞系NB-4细胞获得N2型中性粒细胞,采用低温超高速离心法联合密度梯度离心法提取中性粒细胞培养液上清的外泌体,通过HITACHIS-3000N冷冻扫描电镜观察外泌体的大小、形态以及分子生物学方法对外泌体蛋白成分进行鉴定。将N0或N2中性粒细胞来源的外泌体与COLO205细胞共培养,通过Transwell、细胞克隆形成实验、CCK-8、Western blot、RT-qPCR等方法检测研究NO或N2中性粒细胞来源的外泌体对CRC细胞的影响。通过外泌体miRNA芯片检测的方法筛选N2中性粒细胞外泌体来源的差异miRNA,并通过外源性调控差异mRNA的表达在体外验证其对CRC细胞恶性表型的影响。通过双荧光素酶实验研究了 N2中性粒细胞外泌体中miR-4780对EMT相关蛋白SOX11的靶向及调控作用。同时,通过建立CRC裸鼠转移瘤模型,利用体内成像技术评估小鼠CRC肝转移情况,通过Western blot及免疫荧光检测EMT相关蛋白,证实N2中性粒细胞来源外泌体miR-4780调控CRC的EMT过程。[结 果]1、在纳入标准的30例年龄为34-81岁CRC患者中,其中男性患者19例,女性患者11例,平均年龄为61.32±11.40岁。2、中性粒细胞在CRC、肝细胞癌、胃腺癌、膀胱癌和肺腺癌组织中相对富集。且数据库中CRC TME免疫细胞浸润比例图显示,中性粒细胞占32%,是CRC中浸润程度最高的免疫细胞。提示中性粒细胞在CRC组织中富集。3、CD11b和CD66b在转移CRC组织中的表达比在非转移CRC组织中的表达明显增加,提示中性粒细胞在CRC组织中富集可能与CRC转移有关。4、与N0-exo共培养相比,COLO205与N2-exo共培养后,N2-exo共培养组COLO205增殖、迁移与侵袭能力较明显增强,凋亡率降低。5、通过外泌体miRNA芯片检测的方法筛选外泌体来源的差异miRNA,18个miRNA符合以P<0.05为条件的统计显著性差异要求。6、N2中性粒细胞来源的外泌体来源的miR-4780的过度表达促进了COLO205细胞的侵袭行为和EMT的发生,促进癌细胞转移。7、SOX11是miR-4780的调控靶点,且N2中性粒细胞外泌体来源的miR-4780可被COLO205细胞摄取并调控细胞内SOX11表达。8、N2中性粒细胞来源的外泌体可通过miR-4780抑制CRC细胞内的SOX11表达,并促进CRC的肝转移并加重肝损伤。[结 论]在CRC中,N2中性粒细胞来源的外泌体内的miR-4780可通过靶向下调SOX11而促进CRC的EMT,促进CRC恶性表型,该调控途径可能对CRC的诊断和治疗具有潜在价值。