【摘 要】
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目的:本课题拟通过构建Nrf2基因稳定敲除及Nrf2点突变稳转细胞株,分析观察Nrf2基因对肺癌细胞的功能影响。并研究鸦胆子苦醇对Nrf2过表达野生及突变细胞株毒性作用,比较作用效果有无差异。以期为肺鳞癌临床靶向治疗提供新方向。方法:（1）通过包装慢病毒的方式构建Nrf2永久敲除A549细胞株,挑选单克隆细胞株,提取DNA测序后,根据测序图谱验证细胞敲除效果,挑选纯合子敲除细胞进行实验。通过实时荧
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目,肺癌新致病基因的识别与KEAP1/NRF2基因突变的肺癌靶向药物筛选（NO.8177100416）；
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目的:本课题拟通过构建Nrf2基因稳定敲除及Nrf2点突变稳转细胞株,分析观察Nrf2基因对肺癌细胞的功能影响。并研究鸦胆子苦醇对Nrf2过表达野生及突变细胞株毒性作用,比较作用效果有无差异。以期为肺鳞癌临床靶向治疗提供新方向。方法:（1）通过包装慢病毒的方式构建Nrf2永久敲除A549细胞株,挑选单克隆细胞株,提取DNA测序后,根据测序图谱验证细胞敲除效果,挑选纯合子敲除细胞进行实验。通过实时荧光定量PCR、Western bolt实验验证敲除效果,CCK-8实验比较A549细胞株与Nrf2敲除细胞株的功能差异。（2）用全式金的Fast Mutagenesis System对Nrf2进行定点诱变,使其2号外显子有T35C、G37A、G44C、G187C的点突变。构建稳定高表达野生型及突变型慢病毒质粒,对其进行DNA测序,与NCBI数据库对比,使用测序峰图阅读器软件鉴定测序结果,将测序结果无误的质粒用于稳转细胞株的构建。在倒置荧光显微镜下观察转染效率,通过实时荧光定量PCR、Western bolt、CCK-8实验比较Nrf2突变组与过表达野生组及空载对照组差异。（3）在体外通过CCK-8实验检测不同浓度鸦胆子苦醇（1,2,4,8,10,20,40,80nm）作用过表达野生及点突变肺癌细胞株24小时后,对细胞的毒性作用。通过蛋白印记实验（WB）检测不同浓度鸦胆子苦醇作用于突变细胞株后抗氧化相关蛋白表达水平变化。结果:（1）Nrf2稳定敲除细胞株构建成功,实时荧光定量PCR及Western bolt显示Nrf2敲除后,其下游靶基因转录及蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。CCK-8实验结果表明Nrf2敲除后,A549肺癌细胞的增殖生长能力显著降低（P＜0.01）。（2）过表达野生及突变型稳转细胞株构建成功。实时荧光定量PCR及Western bolt显示过表达野生型与突变型Nrf2肺癌细胞与空载组相比Nrf2及其下游基因转录与蛋白表达水平明显增高（P＜0.01）,尤其是K187突变组细胞Nrf2表达强于其他各组（P＜0.01）。CCK-8法检测细胞增殖能力,结果显示:随着时间推移各组细胞增殖能力不断提高。在48H、72H时稳定过表达野生型及突变型Nrf2细胞株增殖能力与转空载体对照组相比增殖能力明显增强（P＜0.01）,且K187突变组细胞增殖能力强于野生组及其他突变组（P＜0.05）。（3）当鸦胆子苦醇浓度为（1-10n M）时,呈剂量依赖性降低过表达野生型及K187肺癌细胞活力（P＜0.01）,再加大药物浓度对细胞活力影响不大（P＞0.05）。当鸦胆子苦醇浓度为2nm时对K187点突变细胞抑制效果明显优于过表达野生组肺癌细胞（P＜0.01）。不同浓度鸦胆子苦醇作用8小时后,K187细胞株Nrf2及HO-1蛋白表达水平呈剂量依赖性降低（P＜0.01）。结论:（1）Nrf2表达量与肺癌恶性程度呈正相关。Nrf2敲除细胞Nrf2表达量降低,肺癌增殖能力降低。（2）Nrf2点突变细胞Nrf2表达量增加,肺癌增殖能力提高。（3）鸦胆子苦醇可通过靶向抑制Nrf2表达来影响A549肺癌细胞增殖能力。（4）鸦胆子苦醇在特定浓度下对携带Nrf2点突变的肿瘤细胞的抑制效果更强。
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