宫颈癌严重威胁全球女性的生命健康,据国际癌症研究机构(IARC)统计,2020年全球新增近60万病例。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种临床常见的宫颈癌治疗药物,但部分晚期宫颈癌患者最终仍对5-FU产生了耐药性。患者耐药性的发展严重限制了临床药物的使用,这在很大程度上与肿瘤细胞代谢重编程和异质性有关。高效的体外肿瘤模型对于提高药物筛选的效率和临床应用研究的准确性至关重要。多细胞肿瘤球(MTS)具有与体内肿瘤组织相似的生理特征如氧气、营养物质和代谢废物的梯度,以及增强的细胞间相互作用、细胞与细胞外基质间相互作用等。因此MTS可以用作介于2D平面细胞培养和3D移植瘤模型中间的一种过渡肿瘤研究模型。首先,基于液体覆盖方法,本研究建立了一种简单、高效且重复性高的MTS的培养方法,可以实现直径约为500 μm、圆度大于0.9、并具有坏死核心的MTS的高通量制备。该制备方法成功适用于多种肿瘤细胞系(例如,HeLa、HCT116、MCF-7)的3D模型构建,并且还适用于与成纤维细胞UCF和免疫细胞PBMC共培养构建多组分的3D模型,从而实现更为复杂的肿瘤微环境模拟。研究结果表明:MTS内细胞增殖、分裂受阻;与2D单层的HeLa细胞相比,3D MTS中的5-FU耐药性增强,耐药指数为5.72;在补充5 mM谷胱甘肽条件下,3D来源的细胞在2D培养条件下耐药指数为2.91,并维持了一定的3D MTS的表型,具体体现在细胞周期受阻,非线粒体呼吸增强,同时还具有相似的抗性基因表达。然而,来源于3D MTS的HeLa细胞存在增殖缓慢等限制,需要进一步优化培养条件实现其2D平面正常培养。本研究又利用多组学技术对3D培养条件下HeLa细胞的5-FU耐药机制进行了探究。实验数据揭示了 3D MTS蛋白质组和代谢物组的整体重排以及与肿瘤耐药性相关的基因转录水平差异:5-FU对于3D MTS的影响显著小于2D培养,尤其是蛋白表达谱,5-FU处理前后2D培养中有133种差异蛋白质,而3D MTS中仅有27种蛋白表达发生改变。其中,2D培养与3D MTS之间与蛋白质折叠、加工、转运相关的生物过程差异显著,主要以热休克蛋白家族为主,内质网中蛋白质折叠功能的上调促进了内质网稳态的维持。与2D培养相比,在3D MTS中线粒体功能相关的蛋白质显著下调,包括线粒体翻译、线粒体转录、线粒体电子传递。同时研究也发现,在对照和5-FU处理条件下MTS非线粒体呼吸显著上调,这可能是由于MTS中细胞的能量代谢从氧化磷酸化向糖酵解转变导致的。同样的,在对照条件下,相较于2D培养,MTS中TCA循环的中间代谢物显著减少。5-FU处理条件下,2D培养中TCA循环中间代谢产物显著减少;而MTS中谷氨酰胺和谷氨酸的增加在一定程度上补充了 TCA循环通量。此外,在转录和蛋白质水平上,包括层粘连蛋白在内的细胞外基质蛋白的表达在MTS中上调,增强了药物渗透屏障以及包括整合素在内的信号转导途径。此外,缺氧诱导的信号通路的改变和肿瘤细胞干性的增强也与MTS的5-FU耐药性增加有关。总之,本研究建立了一种快速、可扩展、可重复的MTS体外模型,为抗癌药物筛选、肿瘤发生发展、以及个性化肿瘤治疗提供了模型基础。通过结合转录组、蛋白质组、代谢物组数据,系统分析了 2D培养和3D MTS间的表型差异,研究结果明确了糖酵解代谢、内质网稳态和细胞外基质等在HeLa细胞对5-FU的化学耐药性中起关键作用。