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背景与目的: 微管(microtubule)是存在于所有真核细胞中由微管蛋白(tubulin)和微管相关蛋白(microtubule-associated proteins, MAPs)组装成的长管状细胞器结构,通过微管蛋白亚单位的组装和去组装能改变其长度,对低温、高压、秋水仙碱和紫杉醇等敏感,是细胞骨架的主要结构成分之一。在细胞内微管是纺锤体、基粒、中心粒、鞭毛的基本结构成分。在细胞结构的维持、细胞分裂和运动中微管都起着重要作用。
近年来微管已成为抗肿瘤药物的新靶点,紫杉醇、秋水仙碱等药物就是具有显著抗微管活性的物质。其抗肿瘤机制包括:
1. 结合微管蛋白,抑制其装配与去装配的动态平衡而干扰微管的功能,进而导致细胞有丝分裂中止,抑制细胞分裂增殖,诱导肿瘤细胞的凋亡。
2. 通过改变MAPK以及cylinB/P34cdc2等激酶的活性而改变其底物-微管相关蛋白的磷酸化水平,进而干扰细胞的微管系统,使细胞阻滞于有丝分裂期。
3. 作用于多个诱导细胞凋亡的蛋白激酶信号通路:激活Raf-1,使Bcl-2磷酸化,从而诱导凋亡;作用于MAPK,使MAPK活性改变,磷酸化Bcl-2而使细胞凋亡;作用于P34cdc2,通过磷酸化Bcl-2参与细胞凋亡。
土贝母,[Bolbostemma paniculatum(Maxim.)Franquet (Cucurbitaceae)]是一种传统中药,载于清代赵学敏编著的《本草纲目拾遗》。古代用它的块茎来治疗乳岩、乳痈、乳腺增生和瘰疬等疾患。四川省和陕西省的老中医用它来治疗食道癌和胃癌,效果显著,但因恶心、呕吐等消化道副作用而限制了它的临床应用。我们从1978年开始从生药土贝母中分离、纯化抗癌活性成分,并对其中得率最高(1.9%)、水溶性和稳定性较好的土贝母苷甲(下称苷甲)的药效学、药代动力学、毒理学及其作用机制进行了较系统的研究。
我室采用加温聚合—低温解聚两次循环法从新鲜猪脑中提取微管蛋白,经纯度鉴定及定量后作为微管蛋白的样品。用比浊法和离心沉降实验证明苷甲可抑制提取的猪脑微管蛋白聚合,其作用类似于秋水仙碱(本室待发表文章)。
本文试图进一步研究苷甲在K562细胞内对微管的作用,并探讨其通过干扰微管系统诱导K562细胞凋亡的可能机制。
方法:
1. MTT法检测苷甲对K562细胞生长的影响。
2. 采用形态学方法(光学显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜)检查在苷甲作用下K562细胞形态的变化。
3. 用流式细胞术观察和分析在苷甲作用下K562细胞凋亡及周期变化的情况。
4. 细胞免疫荧光法从形态学上观察苷甲对微管蛋白表达及分布的影响。
5. 采用改进的Minotti法提取人红白血病细胞K562内聚合的和解聚的微管蛋白,并用蛋白免疫印迹法来检测苷甲对微管蛋白解聚-聚合的影响。
6. 采用蛋白免疫印迹法检测与微管相关蛋白有关的和与抗微管药物介导凋亡的信号转导通路有关的蛋白激酶Bcl-2、Raf-1、和P34cdc2的表达以及ERK1/2的活性。
结果:
1. 苷甲明显抑制K562细胞的生长,且呈时间剂量依赖关系。苷甲作用K562细胞24、48、72 h的IC50值分别为19.7、18.5、15.9μmol·L-1。
2. 苷甲诱导K562细胞出现典型凋亡细胞的形态学特征:培养的K562细胞经20μmol·L-1苷甲处理24h后,倒置显微镜下可看到细胞体积变大,胞膜出泡。细胞涂片瑞氏-吉姆萨染色可见较多细胞染色质浓聚成团块状,核碎裂。经hoechst33342-PI或AO-EB染色,在荧光显微镜下可观察到经苷甲作用的K562细胞皱缩,变形,染色质浓缩,部分核染色体碎裂。
3. 20μmol·L-1苷甲作用K562细胞6h,流式细胞仪即检出亚倍体峰,G2/M期细胞增多。随着作用时间延长,细胞被阻滞于G2/M期更加明显,细胞的凋亡率也增加。
4. 20μmol·L-1苷甲能明显抑制K562细胞内微管蛋白聚合。
5. 20μmol·L-1苷甲能使K562细胞内的Bcl-2表达降低,并出现磷酸化。苷甲能激活ERK1/2并使c-Raf-1和P34cdc2的表达升高。
结论:
1. 苷甲明显抑制K562细胞的生长,其效果与时间和浓度相关。
2. 苷甲能把K562细胞阻滞在G2/M期并诱导细胞发生凋亡。
3. 苷甲在细胞内能明显抑制微管蛋白聚合,证实其为一种抗微管药物。
4. 苷甲可能通过以下机制诱导细胞周期阻滞和凋亡:抑制微管蛋白聚合进而抑制细胞分裂增殖,诱导凋亡;通过激活ERK及P34cdc2激酶的活性,致微管相关蛋白磷酸化,进而干扰细胞的微管系统,使细胞阻滞于G2/M期;通过激活c-Raf-1,磷酸化Bcl-2,诱导细胞凋亡;激活ERK,导致Bcl-2磷酸化而使细胞凋亡;激活P34cdc2,使Bcl-2磷酸化参与凋亡。