【摘 要】
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增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein,EGFP）是绿色荧光蛋白（GFP）的突变体,发光强度较GFP提高35倍,因其产生自发荧光且发光稳定,被广泛应用于分子标记、显像与示踪等科学研究中。针对EGFP的抗体研究更多的还是传统的多克隆及单克隆抗体,不过传统抗体分子量较大,应用中会因此受限,而纳米抗体是目前已知的具有抗原识别活性的最小抗体单位,其有体积小、穿
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增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein,EGFP）是绿色荧光蛋白（GFP）的突变体,发光强度较GFP提高35倍,因其产生自发荧光且发光稳定,被广泛应用于分子标记、显像与示踪等科学研究中。针对EGFP的抗体研究更多的还是传统的多克隆及单克隆抗体,不过传统抗体分子量较大,应用中会因此受限,而纳米抗体是目前已知的具有抗原识别活性的最小抗体单位,其有体积小、穿透性强、易改造等传统抗体不具备的优势,因此本文致力于寻找高亲和力抗EGFP纳米抗体并开展相关研究。本研究利用噬菌体展示技术,从羊驼（Vicugna pacos）来源的天然噬菌体库中筛选得到抗EGFP纳米抗体,经测序得知其基因序列后,将其构建到真核表达载体上,并转染到HEK293细胞中共表达,通过免疫共沉淀技术检测抗原EGFP与纳米抗体之间的相互作用。由于从天然噬菌体库中得到的抗EGFP纳米抗体亲和力一般,因此本研究对纳米抗体的互补决定区3（complementarity determining region3,CDR3）进行氨基酸定点突变,以期获得亲和力更高的纳米抗体。主要研究内容如下:1、利用大肠杆菌BL21（DE3）表达系统,经镍柱亲和纯化得到EGFP作为噬菌体展示技术中所需抗原;2、采用固相亲和生物淘选的方法筛选得到14个抗EGFP阳性噬菌体克隆,通过酶联免疫吸附检测（ELISA）发现筛选得到的纳米抗体与牛血清白蛋白（BSA）无交叉反应且特异性较好,因此进一步进行多序列比对分析,得到3种纳米抗体基因序列:VHH1、VHH2和VHH3;3、利用基因工程技术将E1-2、E1-12、A2-9和G2-5四个克隆的抗EGFP纳米抗体分别与flag标签融合于pc DNA3.0真核表达载体上,EGFP则与myc标签融合于pc DNA3.0真核表达载体上;然后通过免疫共沉淀技术检测抗原与抗体的相互作用。实验结果显示,两种纳米抗体序列（VHH2和VHH3）的四个实验组（E1-12-（1）、E1-12-（2）、A2-9和G2-5）与抗原EGFP在细胞内有相互作用,但互作能力一般;4、对筛选得到的E1-12纳米抗体的CDR3区进行氨基酸定点突变,结合免疫共沉淀技术,检测到结果中有三个突变体亲和力得到提高,其中突变体E1-12-S104K的亲和力最高,E1-12-S104R和E1-12-S104Q次之。突变体E1-12-S104W、E1-12-S104G、E1-12-S104E的亲和力较E1-12不增反减,突变体E1-12-A99V、E1-12-G100N、E1-12-P103F则失去了与EGFP的亲和力。结果说明CDR3区上的氨基酸对于抗EGFP纳米抗体结合抗原很重要,特别是该区域的热点序列,因此推测可能是由于这些氨基酸参与抗体结合区的结构微调,导致其亲和力变化。
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