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目的:本研究采用DSS法复制小鼠实验性UC模型,在评价黄芪多糖对小鼠UC疗效的同时,观察m Tfh细胞的水平及分化情况,并从ATP/P2X7R信号途径的角度,探究黄芪多糖治疗小鼠UC的可能作用机制。方法:1.模型复制与给药:40只SPF级雄性健康BALB/c小鼠随机分为4组,正常组(Ctrl)、正常+黄芪多糖组(Ctrl+APS)、模型组(DSS)、模型+黄芪多糖组(DSS+APS),每组10只。正常组和正常+黄芪多糖组自由饮水;用超纯水配置3%(w/v)DSS(36,000-50,000 Da)溶液,模型组和模型+黄芪多糖组予以3%DSS自由饮用,连续7天。以小鼠第一次饮用DSS溶液为第1天,停3%DSS后予以超纯水自由饮用直至小鼠处死,从第2天起,各给药组小鼠按体重给予200 mg/kg黄芪多糖溶液灌胃,正常组和模型组按小鼠体重给予等容积的超纯水灌胃,每日固定时间段给药,连续10天。2.黄芪多糖治疗DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的疗效评价:每日记录小鼠体质量,观察小鼠精神状态、毛发色泽,使用OB试纸检测小鼠便血情况并根据说明书进行评分,按照疾病活动指数评分标准进行评分。将小鼠麻醉处死后,取出结肠部分,进行长度的测量及质量的称重,并计算出结肠质量指数,单位长度结肠质量。制作结肠组织病理切片,在显微镜下观察小鼠结肠组织病理损伤情况,并按照镜下病理组织学损伤评分标准进行评分。3.炎症细胞因子及ATP水平检测:用Elisa法检测小鼠结肠组织中炎症细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-17A、IL-21及ATP、ADP、AMP的水平。4.m Tfh细胞及其亚群水平分析:采用流式细胞术对Tfh、m Tfh细胞及其亚群:CD4+CXCR5+(Tfh)、IL-7R+Tfh、IL-10+Tfh(Tfh10)、IL-17+Tfh(Tfh17)、Foxp3+Tfh(Tfr)、Bcl-6+Tfh、Blimp-1+Tfh、PD-1+Tfh、PD-L1+Tfh、CD40L+Tfh、ICOS+Tfh、CXCR3+Tfh(Tfh1)、CCR6+Tfh、CD4+CXCR5+CCR7+(Tcm-Tfh)、CD4+CXCR5+CCR7-(Tem-Tfh)、CD4+CXCR5+CCR7-IL-7R+(Tem-IL-7R+Tfh)、CD4+CXCR5+CCR7-IL-10+(Tem-Tfh10)、CD4+CXCR5+CCR7-IL-17+(Tem-Tfh17)、CD4+CXCR5+CCR7-Foxp3+(Tem-Tfr)、CD4+CXCR5+CCR7-Bcl-6+(Tem-Bcl-6+Tfh)、CD4+CXCR5+CCR7-Blimp-1+(Tem-Blimp-1+Tfh)、CD4+CXCR5+CCR7-PD-1+(Tem-PD-1+Tfh)、CD4+CXCR5+CCR7-PD-L1+(Tem-PD-L1+Tfh)、CD4+CXCR5+CCR7-CD40L+(Tem-CD40L+Tfh)、CD4+CXCR5+CCR7-ICOS+(Tem-ICOS+Tfh)、CD4+CXCR5+CCR7-CXCR3+(Tem-Tfh1)、CD4+CXCR5+CCR7-CCR6+(Tem-CCR6+Tfh)细胞数量的检测,探究黄芪多糖能否调节m Tfh细胞分化及其亚群水平。5.ATP/P2X7R信号途径和Tfh细胞分化相关蛋白检测:采用Western blot方法检测结肠组织中P2X7R、ASC、NEK7、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、My D88、NF-κB p65、P38、p-P38、Src、p-Src、Bcl-6、ICOSL、PSGL-1、CD11a、ICAM-1、FR4蛋白表达水平。6.P2X7、P2X7R m RNA水平检测:采用RT-q PCR方法检测小鼠结肠组织中P2X7、P2X7R m RNA表达水平。7.统计学分析:采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准误(Mean±SEM)表示,两组间比较使用t检验,P<0.05表示差异具有显著性,P<0.01表示差异具有极显著性。结果:1.黄芪多糖治疗DSS诱导的小鼠结肠炎的疗效评价:模型组小鼠自饮用DSS的第4-6天出现体质量急剧下降(P<0.05或P<0.01)、严重便血,毛发干枯,精神萎靡,疾病活动指数评分明显升高(P<0.01),表明小鼠实验性UC模型复制成功。经黄芪多糖给药治疗的小鼠体质量下降缓慢且始终高于模型组(P<0.05),便血程度轻,毛发光泽,精神活动状态良好,疾病活动指数显著低于模型组(P<0.05或P<0.01)。实验结束后对小鼠结肠取材测量后发现,模型组小鼠结肠长度缩短(P<0.01),结肠质量增加(P<0.01),单位长度结肠质量增加(P<0.01),结肠质量指数升高(P<0.01);DSS+APS组小鼠结肠长度增加(P<0.05),结肠质量减轻(P<0.05),单位长度结肠质量降低(P<0.05),结肠质量指数降低(P<0.05),较模型组均有所逆转。镜下病理观察发现,模型组小鼠结肠组织中大量炎性细胞浸润,隐窝结构紊乱,隐窝数量减少,溃疡数量增加;经黄芪多糖治疗后,以上现象明显出现好转,病理损伤评分较模型组明显下降。2.炎症细胞因子及ATP水平检测:采用Elisa法检测发现,与正常组小鼠比较,模型组小鼠结肠组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-7、IL-17A、IL-21水平明显升高(P<0.05或P<0.01),抑炎细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10水平降低(P<0.01),ATP含量升高(P<0.01),ADP、AMP含量减少(P<0.05),同时ADP/ATP和AMP/ATP的数值降低(P<0.01);经黄芪多糖治疗后IL-1β、IL-7、IL-17A、IL-21水平下降(P<0.05),IL-2、IL-4、IL-6、IL-10水平升高(P<0.05),ATP含量下降(P<0.05),ADP、AMP含量增加(P<0.05或P<0.01),ADP/ATP和AMP/ATP的数值升高(P<0.05)。3.m Tfh细胞及其亚群水平分析:采用流式细胞术进行检测,模型组小鼠Tfh、IL-7R+Tfh、Tfh17、Bcl-6+Tfh、PD-1+Tfh、PD-L1+Tfh、CD40L+Tfh、ICOS+Tfh、Tfh1、CCR6+Tfh细胞水平较正常小鼠明显上升(P<0.05),Tfr、Tfh10、Blimp-1+Tfh细胞水平显著下降(P<0.05),与模型组相比,治疗组小鼠Tfh、IL-7R+Tfh、Tfh17、Bcl-6+Tfh、PD-1+Tfh、PD-L1+Tfh、CD40L+Tfh、ICOS+Tfh、Tfh1、CCR6+Tfh细胞水平下降(P<0.05或P<0.01),Tfr、Tfh10、Blimp-1+Tfh细胞水平上升(P<0.05);而对m Tfh细胞及其亚群检测发现,与正常组相比,模型组小鼠Tem-Tfh、Tem-IL-7R+Tfh、Tem-Tfh17、Tem-Bcl-6+Tfh、Tem-PD-1+Tfh、Tem-PD-L1+Tfh、Tem-CD40L+Tfh、Tem-ICOS+Tfh、Tem-Tfh1、Tem-CCR6+Tfh数量增多(P<0.01),Tcm-Tfh、Tem-Tfr、Tem-Tfh10、Tem-Blimp-1+Tfh数量减少(P<0.01),黄芪多糖治疗组小鼠Tem-Tfh、Tem-IL-7R+Tfh、Tem-Tfh17、Tem-Bcl-6+Tfh、Tem-PD-1+Tfh、Tem-PD-L1+Tfh、Tem-CD40L+Tfh、Tem-ICOS+Tfh、Tem-Tfh1、Tem-CCR6+Tfh数量下降(P<0.05或P<0.01),Tcm-Tfh、Tem-Tfr、Tem-Tfh10、Tem-Blimp-1+Tfh数量明显增加(P<0.05)。4.ATP/P2X7R信号途径和Tfh细胞分化相关蛋白检测:采用Western blot法检测结肠组织中蛋白表达水平,发现模型组小鼠P2X7R、ASC、NEK7、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、Bcl-6、ICOSL、PSGL-1、CD11a、ICAM-1、FR4、My D88、NF-κB p65、P38、p-P38、Src、p-Src蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01);治疗组较模型组相比,结肠组织中P2X7R、ASC、NEK7、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、Bcl-6、ICOSL、PSGL-1、CD11a、ICAM-1、FR4、My D88、NF-κB p65、P38、p-P38、Src、p-Src蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。5.P2X7、P2X7R m RNA水平检测:采用RT-q PCR法检测结肠组织中P2X7、P2X7R m RNA水平,模型组小鼠P2X7、P2X7R m RNA水平较正常组小鼠明显升高(P<0.05),治疗组小鼠P2X7、P2X7R m RNA水平较模型组显著降低(P<0.01)。结论:黄芪多糖通过抑制ATP/P2X7R信号调控m Tfh细胞分化有效治疗小鼠结肠炎。