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背景: 目前，在全球范围内，前列腺癌的发病率不断上升，已成为危害老年男性健康的最常见恶性肿瘤之一。转移、激素难治性前列腺癌在治疗上仍然没有有效方法。从免疫学角度分析，肿瘤抗原分为肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原，肿瘤抗原被免疫系统识别，并引发免疫反应，这是肿瘤细胞疫苗发展的基础。所谓肿瘤疫苗是即肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的使用，刺激或加强机体的主动免疫，激发针对肿瘤的特异性免疫反应，从而防止或抑制肿瘤的生长、扩散、复发。肿瘤疫苗是一种生物治疗，与传统的治疗方法（化疗，放疗，手术）比较，最大的好处是，没有明显的毒副作用，能特异性杀伤肿瘤，特别是在肿瘤复发、转移有无可比拟的潜力。 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种拥有多重功效的细胞因子，不仅能够刺激粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的增殖、分化，而且还具有重要的免疫调节功能，尤其是在增强机体抗肿瘤免疫方面。是目前研究和临床上抗肿瘤免疫治疗中较为重要的细胞因子之一。肿瘤坏死因子α(TNFα)是当前抗癌活性最强的细胞因子，它的抗癌机制是多方面的，主要体现在影响肿瘤细胞凋亡，影响肿瘤血管生成和诱导机体主动免疫三方面。将两个有免疫协同效应的细胞因子(GM-CSF和TNFα)共同锚定在前列腺癌细胞株PC-3表面，这样可以激活免疫活性细胞，增强肿瘤的免疫原性，从而可以诱导人体主动抗肿瘤免疫反应的发生，与GM-CSF和TNFα单独锚定修饰相比，可以取得更好的疗效。 本课题关键是，人前列腺癌模型和人外周血淋巴细胞-重度联合免疫缺陷小鼠嵌合体模型(hu-PBL-NOD/SCID)的建立，并用该模型来鉴定GM-CSF/TNFα双重膜表面修饰的PC-3前列腺癌治疗性疫苗的疗效。本课题的研制成功，将使新式肿瘤细胞疫苗，即细胞膜表面锚定修饰疫苗，更具国际竞争力，同时可以作为新式膜表面修饰肿瘤细胞疫苗的范例，造就大量针对各类肿瘤的新式膜表面修饰的肿瘤细胞疫苗，形成拥有知识产权的肿瘤疫苗产业群。 目的: 1通过SDS-PAGE对SA-hGM-CSF和SA-TNFα重组双功能融合蛋白进行鉴定。 2通过流式细胞术检测SA-hGM-CSF和SA-TNFα确证共同锚定在酒精固定的、已生物素化的PC-3前列腺癌细胞株表面及检测其锚定率。 3完成PC-3前列腺癌表面的SA-hGM-CSF和SA-TNFα生物活性测定，即疫苗活性测定。 4 hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型的建立及其鉴定和皮下前列腺癌模型的建立。 5在荷瘤hu-PBL-NOD/SCID小鼠，完成SA-hGM-CSF/SA-TNFα膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗有效性的检测。 方法: 实验中，事先将PC-3前列腺癌细胞30％乙醇固定、生物素化修饰，将带SA的hGM-CSF和TNFα双功能融合蛋白，锚定在PC-3前列腺癌细胞表面，制备成SA-hGM-CSF/SA-TNFα双重膜修饰的前列腺癌治疗性疫苗，然后，建立前列腺癌皮下模型和人外周血淋巴细胞重度联合免疫缺陷鼠嵌合体模型（hu-PBL-NOD/SCID模型），并用该模型来检测疫苗的有效性。首先建立hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型，然后将PC-3前列腺癌细胞（5×105个/mice）肋胁部皮下植入hu-PBL-NOD/SCID小鼠，根据事先分组，在植入后第0，7，14天分别用SA-hGM-CSF/SA-hTNFα双重锚定PC-3疫苗、SA-hGM-CSF单锚定PC-3疫苗、SA-hTNFα单锚定PC-3疫苗、Fixed PC-3、PBS，(i.p.)，治疗荷瘤hu-PBL-NOD/SCID小鼠，观察肿瘤生长情况、小鼠的存活期以及通过免疫组织化学检测肿瘤组织，脾脏、肝脏内CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润情况。 结果: 1纯化、复性的SA-hGM-CSF和SA-TNFα重组融合蛋白，经过SDS-PAGE电泳，在相应分子量处，可以清楚的看到条带，可以形成有活性形式的多聚体。 2流式细胞仪分析链霉亲和素标记(SA)、有生物活性的hGMCSF和/或hTNFα可以有效地锚定在酒精固定，生物素化的PC-3前列腺癌细胞膜表面，而且锚定修饰率达到97％以上。 3通过CCK-8试剂测定锚定在酒精固定的、生物素化的PC-3前列腺癌细胞表面的SA-hGM-CSF和SA-hTNFα仍然具有生物活性。 4 NOD/SCID小鼠移植人外周血单个核细胞4周后，通过流式细胞分析仪，在小鼠脾脏及外周血中可以检测到人CD4、CD8、CD45的存在。 5 PC-3前列腺癌细胞皮下植入后第60天，SA-hGM-CSF/SA-TNFα双重锚定治疗组有5只小鼠存活(5/5)，其中1只体外无肿瘤触及;SA-hGM-CSF单锚定治疗组有4只小鼠存活(4/5);SA-hTNFα单锚定治疗组有3只小鼠存活(3/5);Fixed PC-3有1只小鼠存活(1/5);PBS治疗组全部死亡(0/5)。 结论: 对于荷瘤hu-PBL-NOD/SCID小鼠，GM-CSF/TNFα双重锚定治疗组与SA-hGM-CSF单锚定组(P＜0.05)和SA-TNFα单锚定组(P＜0.05)相比，有更多的CD4，CD8浸润到肿瘤组织，从而能更好地抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠(hu-PBL-NOD/SCI)的生存期。