论文部分内容阅读
流式细胞术是一种对悬液中的细胞或者细胞大小的颗粒进行逐一、多参数、快速定量分析或分选的技术,可在短时间内获得具有统计学意义的表征结果,在单细胞表征方面具有无与伦比的优越性。流式细胞仪可通过细胞或者颗粒的散射光检测获得其尺寸分布、颗粒度及浓度等物理参数,通过检测细胞或者颗粒的自发荧光或特定标记的荧光,实现特异性蛋白表达、酶活性、基因表达等生物化学性状分析。然而传统流式细胞仪因检测灵敏度的限制,其散射检测下限是200-500 nm聚苯乙烯颗粒,难以满足各种功能化纳米颗粒以及病毒、细胞外囊泡等纳米颗粒的粒径及生化性状的表征需求;另外,受限于染料荧光光谱的严重重叠,基于滤波片分光的流式细胞仪需要进行复杂的荧光补偿。结合瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术,本课题组研制了纳米流式检测装置（nano-flow cytometer,nFCM）,在国际上首次将二氧化硅纳米颗粒（silica nanoparticles,SiNPs）、纳米金颗粒（AuNPs）的散射检测下限分别降低至24nm和7 nm。相比于传统流式细胞仪,其散射检测灵敏度提升4-5个数量级。荧光检测下限为3个有机染料分子,其荧光检测灵敏度较传统流式细胞仪提升2-3个数量级。该装置成功应用于天然纳米颗粒（病毒、细胞外囊泡、线粒体、细菌等）和人工合成纳米颗粒（SiNPs、AuNPs、纳米银、纳米药物等）的多参数表征中。本论文基于nFCM前所未有的高灵敏检测性能,针对不同体系的表征需求,对nFCM进行多方位改进,进一步提升灵敏度、拓宽动态检测范围、提高多参数检测能力以及优化仪器硬件以降低背景信号,并将其成功应用于鸡蛋中的细菌检测、细菌外膜囊泡尺寸分布检测、和牛奶中多重致病菌的同时定量分析。本论文的主要工作包含以下几个方面:第一章为文献综述。本章主要介绍流式细胞术的发展历程、工作原理及其发展趋势。此外,还介绍了食品中细菌检测的样品前处理技术和分析方法。在本章最后阐述了本论文的选题思路和研究内容。第二章为三通道nFCM的搭建,并将其应用于鸡蛋中鼠伤寒沙门氏菌和总菌的定量检测。鸡蛋样品基质的复杂性对细菌的检测提出了挑战,在本章中,我们建立了鸡蛋样品前处理方法（稀释、溶解脂质、降解蛋白质、过滤和洗涤等步骤）有效降低了基质的干扰。以鼠伤寒沙门氏菌（S.Typhimurium）为致病菌模型,大肠杆菌K12（E.coliK12）为非致病菌模型,将其混合样添加至无菌鸡蛋中以优化样品前处理方案。结合核酸和免疫荧光染色,无需培养,nFCM可直接对鸡蛋中的鼠伤寒沙门氏菌和细菌总数进行定量检测。该方法可在1.5小时内完成,细菌回收率高达93%,检出限低至2 × 103 cells/mL,对S.Typhimurium的特异性为100%。所建立的方法可以对鸡蛋中S.Typhimurium或其他细菌进行快速的识别和定量分析。第三章为高灵敏、宽动态范围纳米流式检测装置的研制及应用。基于纳米颗粒固有的多分散性（如粒径分布30-1000nm的细胞外囊泡）,对其粒径及分布快速地进行高分辨表征已成为纳米颗粒相关研究和产品开发所面临的一项亟需解决的科学难题。本章采用激光光束整形、双光阑降低背景信号、高量子效率光电倍增管检测器等策略对仪器进行多方位改进,以研制高灵敏、宽动态范围的nFCM。改进后的nFCM可实现直径59 nm SiNPs的高信噪比检测（S/N=119）,可基线分辨59、74、94、123、160、180和222 nm的SiNPs混合样本,相比于以单光子计数雪崩光电二极管（single photon counting avalanche photodiode,APD）为检测器的nFCM,粒径检测范围扩宽约100 nm,并成功应用于鼠伤寒沙门氏菌外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMVs）粒径分布的快速测定。第四章为S-nFCM检测系统的研制。针对传统流式细胞仪在纳米颗粒检测灵敏度不足及多参数检测方面的荧光通道限制等困境,基于第三章中搭建成功的nFCM,本章增加光谱检测模块（体相全息衍射光栅光谱仪分光、电子倍增电荷耦合器件为检测器）、建立高维光谱数据分析方法等策略,研制光谱纳米流式检测系统（spectral nano-flow cytometry,S-nFCM）。经过调试和优化,该系统分辨率可达1.43nm、荧光灵敏度为1000FITC-MESF、每分钟可检测上万张光谱,实现了单个纳米颗粒全荧光光谱的高灵敏、高分辨检测,其高灵敏的检测性能成功应用于枯草芽孢杆菌单个芽孢自发荧光的快速检测。S-nFCM检测系统的研制为纳米颗粒的多参数分析提供先进的技术手段。第五章基于S-nFCM的快速、多参数定量检测等优势,建立了一种多重致病菌与总菌的分析方法。本章中以大肠杆菌O157:H7（E.coli O157:H7）、鼠伤寒沙门氏菌（S.Typhimurium）、单核增生李斯特菌（L.monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）为致病菌模型,大肠杆菌K12（E.coli K12）为非致病菌模型,设计了荧光探针配色及使用方案,建立了多重致病菌和总菌的抗体探针和核酸的双染方法。以人为添加混合菌至牛奶为研究模型,模拟该方法在食品质控中的应用,结果显示该方法可快速对混合菌样本进行快速的致病菌识别和定量分析,展现了其在食品安全质量控制中的巨大应用潜力。第六章为总结与展望。总结了本论文的研究结果,并对后续可进一步研究的工作进行了展望。