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肺癌是目前世界范围内死亡率居首位的恶性肿瘤。与其它癌症不同,肺癌主要由吸烟和环境污染导致。在引发肺癌的环境污染因素中,镉被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)列为Ⅰ类致癌物,但其引发肺癌的机制仍有待进一步研究。环状RNA与癌症的发生密切相关,并参与调控环境致癌物诱导的细胞恶性转化,但其是否参与镉暴露所致的细胞转化尚不清楚。本研究以课题组前期建立的镉转化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)为模型,探讨环状RNA在镉诱导肺癌中的调控作用和机制。第一部分circPUS7在镉致人支气管上皮细胞转化中的作用目的:本课题组前期对镉转化支气管上皮细胞(T-BEAS-2B)和同代对照细胞(C-BEAS-2B)进行环状RNA高通量测序,新发现一个环状RNA分子——circPUS7在T-BEAS-2B细胞中上调两倍以上。因此,本部分对circPUS7的环状RNA分子特征,以及circPUS7对T-BEAS-2B细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长的作用进行研究,并在肺癌H1299细胞中验证circPUS7对细胞恶性表型的调控作用。方法:2μM氯化镉处理BEAS-2B细胞20周,细胞发生转化。在T-BEAS-2B细胞中,通过核糖核酸酶R消化实验、寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸引物扩增实验、放线菌素D实验和核质分离等实验研究circPUS7的环状RNA分子特性。在TBEAS-2B和H1299细胞中敲低或过表达circPUS7,分别通过平板克隆实验、划痕实验、Transwell侵袭实验和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长能力。结果:1.circPUS7是环状RNA:(1)对镉转化细胞的测序发现,与C-BEAS-2B相比,circPUS7(novel_circ_0034496)在T-BEAS-2B细胞中表达显著上调(P<0.05),是新型环状RNA中上升倍数最高的分子。(2)circPUS7是环状结构:与线性PUS7分子相比,circPUS7耐受核糖核酸酶R的消化;与随机六苷酸引物相比,寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸引物不能有效地扩增circPUS7,上述结果说明circPUS7是连续且没有3’末端修饰的环状RNA分子。(3)circPUS7比线性RNA稳定:用放线菌素D抑制T-BEAS-2B细胞转录,circPUS7表达水平从第3个小时开始高于PUS7表达水平(P<0.05),且24小时后仍维持稳定。(4)circPUS7主要分布在胞质:核质分离结果显示约70%的circPUS7存在于细胞质中。(5)对circPUS7进行生物学功能预测,结果显示circPUS7参与调控癌症相关的蛋白聚糖及Hippo信号通路,并与胶质瘤、胰腺癌和肾细胞癌等多种癌症相关。2.circPUS7在镉诱导BEAS-2B细胞转化中的作用:(1)与C-BEAS-2B细胞相比,circPUS7在T-BEAS-2B细胞中表达上调超过2倍(P<0.01),此外,在镉诱导细胞转化过程中,circPUS7表达水平随镉染毒时间增加呈现上升趋势,并在镉诱导细胞转化的第12、16和20周显著上调(P<0.01)。(2)circPUS7促进TBEAS-2B细胞恶性表型:与NC转染组相比,敲低circPUS7显著抑制T-BEAS-2B细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长;与Vector转染组相比,过表达circPUS7促进了T-BEAS-2B细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长。3.circPUS7在肺癌细胞系中表达上调并促进H1299细胞的恶性表型:(1)与BEAS-2B细胞相比,circPUS7在肺癌细胞系H1299、H460和A549细胞中表达上调(P<0.05或P<0.01)。(2)与NC转染组相比,敲低circPUS7显著抑制了H1299细胞增殖、迁移和侵袭(P<0.05或P<0.01);与Vector转染组相比,过表达circPUS7促进了H1299细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长(P<0.05或P<0.01)。结论:circPUS7是一个主要分布在细胞质中稳定的环状RNA分子,其在镉诱导细胞转化的中、后期显著上调,并促进T-BEAS-2B细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长。此外,circPUS7促进肺癌H1299细胞的恶性表型。第二部分circPUS7通过吸附miR-770调控KRAS促进镉致人支气管上皮细胞转化目的:确定circPUS7直接结合的微小RNA(micro RNA,miRNA),研究该miRNA分子对T-BEAS-2B细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长的作用,并探索circPUS7-miR-770轴的下游作用机制。方法:在T-BEAS-2B细胞中,检测FUS或NF90/NF110蛋白表达,以及敲低FUS或NF90/NF110对circPUS7表达的改变。通过生物信息学预测和双荧光素酶报告基因等实验确定circPUS7与miR-770直接结合,在T-BEAS-2B细胞中过表达miR-770,检测miR-770对细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长能力的影响,以及对下游KRAS蛋白表达影响。通过回复实验检测circPUS7通过miR-770调控T-BEAS-2B细胞恶性表型及KRAS蛋白表达。结果:1.circPUS7上游调控机制研究:(1)与C-BEAS-2B细胞相比,T-BEAS-2B细胞中FUS、NF90和NF110蛋白表达显著上调。(2)与NC转染组相比,用si-FUS处理T-BEAS-2B细胞导致circPUS7表达水平降低至对照细胞表达水平的70%左右(P<0.05);与NC转染组相比,敲低NF90/NF110可显著抑制circPUS7表达水平(P<0.01)。2.circPUS7下游调控机制研究:(1)确定靶miRNA:通过生物信息学软件预测和丰度检测,miR-770是评分前十、表达丰度高且存在circPUS7潜在结合位点的miRNA,双荧光素酶报告基因实验显示miR-770可与circPUS7分子直接结合。(2)miR-770抑制T-BEAS-2B细胞恶性表型:在T-BEAS-2B细胞中过表达miR-770,与mimic对照转染组相比,miR-770表达升高显著抑制了T-BEAS-2B细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长(P<0.05或P<0.01)。(3)circPUS7通过吸附miR-770促进镉诱导细胞发生转化:共转si-circPUS7和miR-770 inhibitor可回复circPUS7敲低对细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长的抑制作用。(4)circPUS7通过吸附miR-770促进KRAS蛋白表达:Western blot结果显示过表达miR-770显著抑制T-BEAS-2B细胞中KRAS蛋白的表达;KRAS蛋白在镉诱导BEAS-2B细胞转化的第12、16和20周显著升高,与circPUS7表达改变趋势一致;此外,与C-BEAS-2B细胞相比,KRAS蛋白在T-BEAS-2B细胞中表达上调,敲低circPUS7显著抑制KRAS蛋白表达,但共转si-circPUS7和miR-770 inhibitor可回复KRAS蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。上述结果说明circPUS7可以调控miR-770靶基因KRAS的表达,进而促进镉引起的BEAS-2B细胞转化。结论:circPUS7通过吸附miR-770促进KRAS蛋白表达,并促进T-BEAS-2B细胞增殖、迁移、侵袭和锚定非依赖性生长。