背景与目的： 肝刺激因子（Hepatic Stimulator Substance,HSS）为从新生动物肝脏或从部分肝切除术后的残余肝脏中提取的一种活性蛋白。它是一种热稳定蛋白，分子量约为15kD。既往实验表明，与目前所知的几种具有肝脏保护及促肝细胞再生作用的细胞因子例如HGF等相比，只有HSS可特异性地刺激肝细胞或肝源性肿瘤细胞增殖；并可减轻CCl4、半乳糖胺及双氧水等药物对肝细胞的损伤；HSS还具有抑制纤维化及抗病毒的作用；此外，肝刺激因子的表达可增强肝癌细胞BEL-7402的抗调亡能力。HSS为何对肝脏具有特异性的作用，解决这一问题的关键在于如何获得更多HSS在细胞内的信息。 为此，本实验构建了人肝刺激因子 (hHSS)的增强型绿色荧光蛋白 (Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)真核表达载体，导入人肝癌细胞系BEL-7402中，使hHSS-EGFP融合蛋白表达，旨在探讨hHSS的亚细胞定位。另外，由于人肝刺激因子的亚细胞定位信号未知，所以我们构建了pEGFP-C1-hHSS和pEGFP-N1-hHSS两种重组质粒，通过比较N端与C端这两种载体转染细胞后的不同效应，粗略推测hHSS亚细胞定位的信息所在。 方法： 合成带有不同酶切位点的引物，运用PCR方法，从质粒pUC18-hHSS中扩增出人肝刺激因子基因开放阅读框序列，作为目的片段，用T-A克隆方法连至pMD18-T载体，再分别定向克隆至pEGFP-C1和pEGFP-N1两种真核绿色荧光蛋白表达载体，获得两种重组质粒pEGFP-C1-hHSS和pEGFP-N1-hHSS。将两种重组质粒用不同的限制性内切酶酶切并进行测序鉴定，再将重组的两种质粒经脂质体介导转染人肝癌BEL-7402细胞，用激光共聚焦显微镜观察其定位，比较两种载体的不同效应，并初步确定hHSS的亚细胞定位及hHSS定位信号所在位置。 结果： 1．测序结果显示两种重组载体中的hHSS序列正确，开放阅读框无移码突变。 2．转染了pEGFP-N1-hHSS细胞中表达的绿色荧光蛋白，于转染24h后呈弥散状态，在胞浆和胞核都有分布；48h后主要聚集于胞浆中，核周的胞浆中可见粗颗粒状荧光物质的聚集，可能为高尔基体，胞浆和核的界线明显，胞核亦可见少量的绿色荧光蛋白；72h后在胞浆内呈斑点状散在分布，胞浆内的部分与复染的红色荧光(代表线粒体)重叠成黄色；96h后清晰聚集于胞浆内，在胞核周围呈散在分布，与复染的红色荧光重叠成黄色。 3．转染了pEGFP-C1-hHSS细胞中表达的绿色荧光蛋白，未见明显的动态变化过程。于转染后混合分布于细胞内，以粗颗粒荧光为主，胞浆、核及细胞膜的界限不明显，胞浆中可见未染色的圆形空洞，与复染的红色荧光（代表线粒体）和蓝色荧光（代表胞核）都有重叠。转染后96h，可观察到绿色荧光在胞浆内的聚集，但其与红色荧光并不完全重叠。 结论： 1．成功构建了hHSS的增强型绿色荧光蛋白的重组真核表达载体。 2．重组质粒pEGFP-C1-hHSS与pEGFP-N1-hHSS相比，pEGFP-N1-hHSS的定位有特异性，而pEGFP-C1-hHSS的定位没有特异性，说明hHSS的定位信号位于氨基端。 3．初步观察了hHSS与EGFP融合基因表达后在BEL-7402细胞中的定位，hHSS定位以胞浆中的线粒体为主。