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病毒的入侵与传播能够引起人体的多种疾病，严重威胁着人类的生命健康，如H1N1等流感病毒能够引起大规模的流行性感冒；寨卡病毒能够导致小头症并具有高致死率；HIV病毒能够破坏人体的免疫系统引起获得性免疫缺陷综合征；HSV病毒能够引起脑炎、角膜炎、疱疹等疾病；HAV、HBV、HCV等引起不同类型的病毒性肝炎，以及2003年肆虐我国的SARS病毒和2020年春节前夕爆发的由新型冠状病毒COVID-19引起的严重肺炎疫情，短时间内使免疫系统功能紊乱诱发炎症风暴，并伴发多个器官衰竭，给人们的生命健康带来了巨大的威胁。
免疫系统是机体抵抗病毒入侵的重要守卫者，它包括天然免疫和适应性免疫两道防线。其中，天然免疫是抵抗病毒入侵的第一道防线，包括皮肤、黏膜等免疫结构及巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞。T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule-3，Tim-3)，最早被发现表达在CD4+Th1细胞上，是Tim家族的重要一员[1]。由HAVCR2基因编码，301个氨基酸组成。Tim家族蛋白都由一段胞外结构域，包括N端的一个富含半胱氨酸的免疫球蛋白可变区(IgV)结构域和一个介导糖基化作用的黏蛋白样区，跨膜区以及位于C端的含有有机磷酸化位点的胞内结构域组成[2]。Tim-3分子自被发现以来，针对其研究多围绕适应性免疫应答，尤其是该分子在肿瘤微环境中作为免疫检查点分子的调控作用展开。近年来，我们的研究及相关文献证实Tim-3在巨噬细胞，DC细胞及NK细胞上均能够检测到其表达，发现其在天然免疫中也发挥着重要的调控作用[3]。那么，Tim-3是否参与了抗病毒天然免疫应答的调控过程，又是以怎样的方式发挥作用呢？
核因子90(Nuclear factor 90，NF90)是由白细胞介素增强结合因子-3(Interleukin en hanced binding factor-3，ILF3)基因编码的，主要分布于细胞核内的一种核蛋白。研究发现，ILF3基因存在多种可变剪接模式，导致NF90在转录后翻译水平形成多种同型异构体，最终使得NF90成为一个特殊的蛋白家族[4]。随着对NF90研究的不断深入，使得对NF90在病毒感染中发挥的重要调控作用的关注越来越热，同时也引起了本课题组对病毒感染研究更大的兴趣。文献调研发现，NF90参与H1N1、埃博拉病毒、VSV等多种RNA病毒的感染进程，三种病毒同属单链RNA病毒属，并且NF90对这一类型病毒的入侵均发挥抑制作用[5]。同时，研究发现，NF90启动抗病毒感染的下游分子信号不是经典的干扰素I途径，而是通过激活胞浆蛋白聚集并形成应激性颗粒(Stress Granual, SGs)，病毒基因被包裹在颗粒中，在NF90和多种关键蛋白的作用下抑制病毒的复制[6]，从而发挥抗病毒的作用。我们的前期研究提示Tim-3参与了NF90的调控作用，但两者之间发挥作用的具体机制及其意义，仍需进一步探究。
在病毒成功侵入人体的第一道防线后，机体发生慢性感染，T细胞逐渐出现适应性免疫调节，导致多种细胞因子的产生，如白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)等[7-8]，抵抗感染或炎症反应，维持免疫微环境稳态。其中，IL-2是适应性免疫应答中关键的抑炎细胞因子。根据文献调研，Tim-3能够影响IL-2的表达，但具体的机制尚不完全明确，IL-2的产生机制主要由两种方式进行调控：一方面，核因子-κB(NF-κB)、核因子-AT(NF-AT)及转录激活因子-1(AP-1)对IL-2的转录激活作用[9-10]；另一方面，细胞内的蛋白激酶C(PKCβ1)信号的活化能够增强mRNA的稳定性，从而实现基因的翻译及翻译后修饰[11]，那么我们对Tim-3是否通过影响以上信号途径的活化，从而抑制IL-2的表达进行探究。
以上研究发现，Tim-3在天然免疫及适应性免疫应答中能够影响不同的信号分子，发挥重要的调控作用，但目前未发现两种信号通路之间存在交叉的有明显影响的蛋白分子，因此，小分子抑制剂的研发及其使用可能在抗病毒感染过程中的作用难以凸显。我们发现Tim-3阻断抗体的使用，则能够明显提高免疫系统的抗病毒感染能力，试图将Tim-3抗体的应用拓宽至抗病毒感染领域。目前国际上Tim-3抗体在研的项目已有十三个之多，但国内尚未有自主知识产权的Tim-3靶向抗体药物被成功研发。鉴于实验室前期的研究基础，我们基于计算机分子结构模拟平台，利用哺乳动物细胞抗体库技术，对实验室现有Tim-3抗体进行一定程度的优化，对定点突变后的抗体进行筛选与鉴定，得到亲和力较高，全新序列的全长Tim-3抗体，致力于Tim-3靶向药物的研发。
本课题为了明确Tim-3在天然免疫抗病毒感染中的重要调控作用，探究Tim-3在抗RNA病毒感染过程中的调控NF90的作用模式，为天然免疫抗病毒感染的研究提供新的视角。利用常见的DNA病毒HSV和RNA病毒H1N1及VSV分别感染RAW264.7细胞系，使用QRT-PCR和Westernblot技术，探究在巨噬细胞中RNA病毒对Tim-3基因转录和蛋白表达的影响；向6-8周龄的Tim-3+/+和Tim-3-/-模式动物腹腔注射VSV，并设置PBS组对照，感染结束后，取腹腔巨噬细胞及脾肺组织，利用QRT-PCR技术及生死率统计等方法，明确Tim-3缺失后是否有减轻炎症损伤程度并提高机体生存率的影响。除此以外，构建Tim-3、TRIM47的标签质粒及NF90突变体质粒，利用免疫共沉淀技术，确定三者之间共同调控病毒感染过程的具体作用模式及结构域位点。Tim-3能够在RNA病毒(如H1N1,VSV等)入侵过程中，出现基因及蛋白水平的一过性高表达；HE染色肺组织切片及致死剂量感染模式动物，各种结果均显示出高表达水平Tim-3的加剧了机体的病毒感染进程；Tim-3能够通过TRIM47促进NF90-DZF-Lys297位点的K48泛素化修饰，介导免疫逃逸。
本课题为了进一步探究Tim-3在适应性免疫应答中调控IL-2表达的信号通路，利用JurkatTim-3-high与JurkatTim-3-low细胞系，经PMA/PHA活化后，用QRT-PCR方法测定IL-2的基因转录水平的变化，用ELISA及FACS方法测定IL-2蛋白水平的变化并使用Westernblot方法对Tim-3影响IL-2的磷酸化通路进行探究。JurkatTim-3-low细胞系中IL-2的蛋白表达水平明显高于JurkatTim-3-high细胞系。使用Tim-3抗体对Tim-3蛋白进行功能阻断，JurkatTim-3-high细胞系中IL-2的基因及蛋白水平得到明显提高，PKCβ1与P65蛋白的磷酸化水平明显增强。
本课题基于Tim-3靶点在天然免疫及适应性免疫应答调控中的重要作用，针对实验室常用Tim-3抗体，通过计算机辅助分子模型构建平台与哺乳动物细胞抗体库技术，以及OverlapPCR、载体的酶切、酶连与转化等分子生物学技术，通过基因序列测序比对与ELISA方法筛选获得一定程度优化的全新序列抗体，成功构建富含序列多样性的抗体分子质粒库。Tim-3抗体的使用能够在天然免疫中增强抗病毒感染能力，并在适应性免疫应答中提高机体细胞因子表达，基于Tim-3靶点的抗体优化，为未来Tim-3靶向药物的研发上市提供一定的借鉴意义。
综上所述，本课题围绕Tim-3靶点对其在天然免疫及适应性免疫应答中的信号通路进行了深入探究，并将基础研究与应用研究相结合。我们必须高度重视病毒引起的疾病及其带来的严重后果，对机体的抗病毒感染的免疫调控机制做更深层次的研究，在基础研究中发现关键作用分子，并拓展至应用研究，力求为未来临床病毒性疾病的治疗及病毒传染病的传播起到强有力的理论支撑并做出更合理有效的治疗方案。
免疫系统是机体抵抗病毒入侵的重要守卫者，它包括天然免疫和适应性免疫两道防线。其中，天然免疫是抵抗病毒入侵的第一道防线，包括皮肤、黏膜等免疫结构及巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞。T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule-3，Tim-3)，最早被发现表达在CD4+Th1细胞上，是Tim家族的重要一员[1]。由HAVCR2基因编码，301个氨基酸组成。Tim家族蛋白都由一段胞外结构域，包括N端的一个富含半胱氨酸的免疫球蛋白可变区(IgV)结构域和一个介导糖基化作用的黏蛋白样区，跨膜区以及位于C端的含有有机磷酸化位点的胞内结构域组成[2]。Tim-3分子自被发现以来，针对其研究多围绕适应性免疫应答，尤其是该分子在肿瘤微环境中作为免疫检查点分子的调控作用展开。近年来，我们的研究及相关文献证实Tim-3在巨噬细胞，DC细胞及NK细胞上均能够检测到其表达，发现其在天然免疫中也发挥着重要的调控作用[3]。那么，Tim-3是否参与了抗病毒天然免疫应答的调控过程，又是以怎样的方式发挥作用呢？
核因子90(Nuclear factor 90，NF90)是由白细胞介素增强结合因子-3(Interleukin en hanced binding factor-3，ILF3)基因编码的，主要分布于细胞核内的一种核蛋白。研究发现，ILF3基因存在多种可变剪接模式，导致NF90在转录后翻译水平形成多种同型异构体，最终使得NF90成为一个特殊的蛋白家族[4]。随着对NF90研究的不断深入，使得对NF90在病毒感染中发挥的重要调控作用的关注越来越热，同时也引起了本课题组对病毒感染研究更大的兴趣。文献调研发现，NF90参与H1N1、埃博拉病毒、VSV等多种RNA病毒的感染进程，三种病毒同属单链RNA病毒属，并且NF90对这一类型病毒的入侵均发挥抑制作用[5]。同时，研究发现，NF90启动抗病毒感染的下游分子信号不是经典的干扰素I途径，而是通过激活胞浆蛋白聚集并形成应激性颗粒(Stress Granual, SGs)，病毒基因被包裹在颗粒中，在NF90和多种关键蛋白的作用下抑制病毒的复制[6]，从而发挥抗病毒的作用。我们的前期研究提示Tim-3参与了NF90的调控作用，但两者之间发挥作用的具体机制及其意义，仍需进一步探究。
在病毒成功侵入人体的第一道防线后，机体发生慢性感染，T细胞逐渐出现适应性免疫调节，导致多种细胞因子的产生，如白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)等[7-8]，抵抗感染或炎症反应，维持免疫微环境稳态。其中，IL-2是适应性免疫应答中关键的抑炎细胞因子。根据文献调研，Tim-3能够影响IL-2的表达，但具体的机制尚不完全明确，IL-2的产生机制主要由两种方式进行调控：一方面，核因子-κB(NF-κB)、核因子-AT(NF-AT)及转录激活因子-1(AP-1)对IL-2的转录激活作用[9-10]；另一方面，细胞内的蛋白激酶C(PKCβ1)信号的活化能够增强mRNA的稳定性，从而实现基因的翻译及翻译后修饰[11]，那么我们对Tim-3是否通过影响以上信号途径的活化，从而抑制IL-2的表达进行探究。
以上研究发现，Tim-3在天然免疫及适应性免疫应答中能够影响不同的信号分子，发挥重要的调控作用，但目前未发现两种信号通路之间存在交叉的有明显影响的蛋白分子，因此，小分子抑制剂的研发及其使用可能在抗病毒感染过程中的作用难以凸显。我们发现Tim-3阻断抗体的使用，则能够明显提高免疫系统的抗病毒感染能力，试图将Tim-3抗体的应用拓宽至抗病毒感染领域。目前国际上Tim-3抗体在研的项目已有十三个之多，但国内尚未有自主知识产权的Tim-3靶向抗体药物被成功研发。鉴于实验室前期的研究基础，我们基于计算机分子结构模拟平台，利用哺乳动物细胞抗体库技术，对实验室现有Tim-3抗体进行一定程度的优化，对定点突变后的抗体进行筛选与鉴定，得到亲和力较高，全新序列的全长Tim-3抗体，致力于Tim-3靶向药物的研发。
本课题为了明确Tim-3在天然免疫抗病毒感染中的重要调控作用，探究Tim-3在抗RNA病毒感染过程中的调控NF90的作用模式，为天然免疫抗病毒感染的研究提供新的视角。利用常见的DNA病毒HSV和RNA病毒H1N1及VSV分别感染RAW264.7细胞系，使用QRT-PCR和Westernblot技术，探究在巨噬细胞中RNA病毒对Tim-3基因转录和蛋白表达的影响；向6-8周龄的Tim-3+/+和Tim-3-/-模式动物腹腔注射VSV，并设置PBS组对照，感染结束后，取腹腔巨噬细胞及脾肺组织，利用QRT-PCR技术及生死率统计等方法，明确Tim-3缺失后是否有减轻炎症损伤程度并提高机体生存率的影响。除此以外，构建Tim-3、TRIM47的标签质粒及NF90突变体质粒，利用免疫共沉淀技术，确定三者之间共同调控病毒感染过程的具体作用模式及结构域位点。Tim-3能够在RNA病毒(如H1N1,VSV等)入侵过程中，出现基因及蛋白水平的一过性高表达；HE染色肺组织切片及致死剂量感染模式动物，各种结果均显示出高表达水平Tim-3的加剧了机体的病毒感染进程；Tim-3能够通过TRIM47促进NF90-DZF-Lys297位点的K48泛素化修饰，介导免疫逃逸。
本课题为了进一步探究Tim-3在适应性免疫应答中调控IL-2表达的信号通路，利用JurkatTim-3-high与JurkatTim-3-low细胞系，经PMA/PHA活化后，用QRT-PCR方法测定IL-2的基因转录水平的变化，用ELISA及FACS方法测定IL-2蛋白水平的变化并使用Westernblot方法对Tim-3影响IL-2的磷酸化通路进行探究。JurkatTim-3-low细胞系中IL-2的蛋白表达水平明显高于JurkatTim-3-high细胞系。使用Tim-3抗体对Tim-3蛋白进行功能阻断，JurkatTim-3-high细胞系中IL-2的基因及蛋白水平得到明显提高，PKCβ1与P65蛋白的磷酸化水平明显增强。
本课题基于Tim-3靶点在天然免疫及适应性免疫应答调控中的重要作用，针对实验室常用Tim-3抗体，通过计算机辅助分子模型构建平台与哺乳动物细胞抗体库技术，以及OverlapPCR、载体的酶切、酶连与转化等分子生物学技术，通过基因序列测序比对与ELISA方法筛选获得一定程度优化的全新序列抗体，成功构建富含序列多样性的抗体分子质粒库。Tim-3抗体的使用能够在天然免疫中增强抗病毒感染能力，并在适应性免疫应答中提高机体细胞因子表达，基于Tim-3靶点的抗体优化，为未来Tim-3靶向药物的研发上市提供一定的借鉴意义。
综上所述，本课题围绕Tim-3靶点对其在天然免疫及适应性免疫应答中的信号通路进行了深入探究，并将基础研究与应用研究相结合。我们必须高度重视病毒引起的疾病及其带来的严重后果，对机体的抗病毒感染的免疫调控机制做更深层次的研究，在基础研究中发现关键作用分子，并拓展至应用研究，力求为未来临床病毒性疾病的治疗及病毒传染病的传播起到强有力的理论支撑并做出更合理有效的治疗方案。