胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus),属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲤形目(Cypriniformes)、胭脂鱼科(Catostomidae),是我国特有的淡水鱼类,主要分布于长江和闽江。因其体型别致、体色艳丽、肉质鲜美,兼具观赏价值和经济价值。近年来,由于胭脂鱼自身繁殖率低,同时受环境污染、过度捕捞等人类活动的影响,从而导致其数量逐渐减少。人工繁殖不失为保护胭脂鱼种群的一种有效途径,但在养殖过程中,病害、水质等问题的存在也会造成胭脂鱼的高死亡率,不利于胭脂鱼养殖业的健康发展。本研究基于对鱼类免疫系统结构和功能的了解,试图对胭脂鱼T细胞的表面标志分子进行研究,希望为解决胭脂鱼水产养殖过程中所存在的病害防治问题提供理论依据。免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统,鱼类作为最早具有初步完整免疫系统的低等脊椎动物,在免疫系统进化历程研究中占有重要地位。所以,对鱼类免疫系统进行研究可为进一步了解脊椎动物免疫系统的进化规律提供理论基础。免疫系统分为固有免疫和适应性免疫,而适应性免疫又包括体液免疫和细胞免疫,其中细胞免疫是以T淋巴细胞介导的免疫应答。CD4作为重要的T淋巴细胞表面标志分子,可与MHCⅡ类分子结合形成抗原-MHCⅡ分子复合物,从而参与体液免疫和引起炎症反应。然而,目前关于T细胞表面标志分子在胭脂鱼的研究中还未见报道。本文通过对转录组测序数据进行分析获得了胭脂鱼的CD4序列,开放式阅读框长1443bp,编码481个氨基酸,预测的蛋白质分子量约为53.89kDa,等电点为8.88。氨基酸多重序列比对结果显示,与其他物种相似,胭脂鱼CD4分子由含有3个Ig结构域和1个Ig-like结构域的胞外区、跨膜区和包含保守CXC基序的胞质区组成。同时,该CD4分子的胞外区存在WTC基序、N-糖基化位点和形成二硫键的半胱氨酸残基等保守位点和基序。系统进化树分析表明,胭脂鱼CD4与草鱼、鲤鱼、鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系较近。胭脂鱼发育时期半定量RT-PCR结果表明:CD4的转录本在胭脂鱼的受精卵中就可检测到,但CD4转录水平极其低;同时随着时间的增加,从胭脂鱼受精卵开始至出膜51天中均可检测到CD4的转录本,并且其m RNA水平逐渐升高且趋于稳定。胭脂鱼各组织半定量RT-PCR结果表明:CD4 mRNA水平在免疫器官鳃中最高,在脾脏、心脏和PBL中较高,在肌肉和皮肤中较低。用灭活的嗜水气单胞菌刺激胭脂鱼后,qRT-PCR结果表明:在48h时,在脾脏、头肾和肾脏中均检测到CD4 mRNA水平的上升,并且在脾脏和头肾中的上升水平程度更大;在鳃和肠中,在24h时就检测到CD4 mRNA水平的上升。利用大肠杆菌进行原核表达获得了抗原性较强的CD4胞外段蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot对其进行检测,该CD4重组蛋白主要以包涵体形式进行表达,分子量约为36 KDa。以CD4重组蛋白作为抗原,免疫5-6周龄Balb/c雌性小鼠,获得了鼠抗胭脂鱼CD4血清,并利用细胞融合技术制备了能够分泌抗CD4单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为8-G7B12、4-F2C3、8-G6C1和11-F6A4。Western blot结果显示:这些抗体均可与胭脂鱼的头肾总蛋白中分子量约为25 KDa的蛋白发生特异性反应。利用抗胭脂鱼CD4单克隆抗体,通过间接免疫荧光对胭脂鱼外周血白细胞进行检测,结果从中发现了CD4+白细胞的存在。同时,利用该抗体对胭脂鱼胸腺、头肾和脾脏进行免疫组织化学染色,结果显示:在胸腺、头肾和脾脏中均观察到黄棕色阳性信号,并且发现在胸腺中CD4阳性细胞较多,而在头肾和脾脏中CD4阳性细胞较少;在阴性对照中未观察到黄棕色阳性信号。本研究获得了胭脂鱼CD4部分cDNA序列,分析了CD4的表达模式,构建载体,原核表达得到了重组蛋白,制备并鉴定了抗胭脂鱼CD4单克隆抗体,初步探究了CD4+细胞在胭脂鱼主要免疫器官中的分布特征。鉴于CD4+T细胞在适应性免疫系统中发挥的作用,抗胭脂鱼CD4单克隆抗体的获得,期待为胭脂鱼免疫系统的结构和功能及鱼类T细胞亚群的分类和功能研究奠定基础。