论文部分内容阅读
急性心肌梗死是临床最为常见的心血管急危重症，其并发症心力衰竭及心律失常的发生常常是许多患者死亡的主要原因。近年来大量研究表明运用骨髓间充质干细胞（MSCs）移植替代心梗后缺血凋亡的心肌细胞，促进梗死区域心肌细胞再生以及局部毛细血管网和侧枝循环的形成，可使心功能得到一定程度的改善。然而心梗后受损心肌局部缺血缺氧微环境导致MSCs移植后出现凋亡，细胞存活率过低，从而限制了MSCs对损伤心肌的修复能力，影响其移植疗效。因此如何加强MSCs对缺血缺氧的耐受性，促进MSCs在心肌梗死后的缺血和营养剥夺的病理微环境中生存，寻找有效靶点抑制MSCs凋亡，从而提高MSCs的治疗效果，成为目前亟待解决的研究重点。 近年来研究显示，中药预处理MSCs既可以起到抗凋亡的作用，也可影响和改善其微环境，促进其存活与功能的建立，且中药具有临床应用安全性和长期有效性的特点，显示出良好的临床应用前景。黄芪甲苷是中药黄芪的有效成分之一，既往研究已证实其具有抗凋亡、抗氧化、减少炎症产物等作用，如能进一步探寻黄芪甲苷预处理对缺血缺氧环境下MSCs凋亡情况的影响及其作用机制，提高MSCs移植疗效，将促进中医药在干细胞和心血管病研究中的作用，为临床提供可供选择的更高效且安全的MSCs治疗方案，从而推进MSCs治疗心血管疾病的临床应用进程。 目的：观察黄芪甲苷预处理对无血清及缺氧诱导MSCs凋亡的影响及探讨其可能作用机制，为黄芪甲苷应用于MSCs移植治疗心血管疾病提供理论依据。 方法：采用密度梯度离心法分离培养大鼠MSCs，进行形态学观察，绘制生长曲线，流式细胞仪检测MSCs表面标记物，分别向成骨、成脂方向诱导分化；通过药物细胞毒性试验检测黄芪甲苷对MSCs细胞活性的影响；分别以40、80、160μg/mL的黄芪甲苷预处理MSCs24h，后进行无血清及缺氧培养24h，细胞核荧光染色观察细胞凋亡情况，用流式细胞仪检测细胞凋亡率及线粒体膜电位，RT-PCR法检测细胞中Bcl-2、Bax、caspase-3、TGF-β1以及TNF-α的基因表达情况，Western-blot法检测细胞中Bcl-2、Bax以及caspase-3的蛋白表达情况。 结果：密度梯度离心法可有效分离大鼠MSCs；细胞表面抗原CD29、CD44阳性，CD31、CD34阴性；MSCs经成骨诱导后，茜素红染色呈阳性；MSCs经成脂诱导后，油红O染色呈阳性；各浓度黄芪甲苷对MSCs细胞活力均无影响；Hoechst33342染色显示经黄芪甲苷预处理可减少细胞凋亡的形态学改变，Annexin V/PI双染法证实80、160μg/mL黄芪甲苷预处理MSCs细胞凋亡率比无血清缺氧组降低，差异有极显著统计学意义；JC-1荧光探针检测证实80、160μg/mL黄芪甲苷预处理MSCs线粒体膜电位比无血清缺氧组升高，差异有显著统计学意义；无血清及缺氧诱导可上调Bax以及caspase-3等基因及蛋白的表达，下调Bcl-2以及TGF-β1等基因及蛋白表达；黄芪甲苷可下调Bax及caspase-3等基因及蛋白的表达，上调Bcl-2以及TGF-β1等基因及蛋白表达。 结论：无血清及缺氧诱导的MSCs凋亡可能是由于缺氧及生长因子匮乏的刺激所引起的，并通过线粒体通路介导凋亡信号的传递。黄芪甲苷可抑制无血清及缺氧诱导的MSCs凋亡，其作用机制可能是提高MSCs在缺血缺氧环境下合成生长因子的能力，并通过上调抗凋亡基因，下调促凋亡基因，抑制线粒体膜电位的降低而起到保护线粒体功能的作用，由此减少促凋亡蛋白的释放，阻止caspase级联反应的启动。