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本课题运用化学分析方法、现代仪器手段,生物学前沿技术,首次系统地探讨了不同水解度花生多肽的制备技术、低水解度多肽中血管紧张肽转化酶(angiotensinconverting enzyme,ACE)抑制活性的肽段序列的检测,以及高水解度花生多肽的生物活性研究等问题。研究结论与创新点如下:
1.不同水解度的花生多肽的制备与分析
本文以冷榨花生饼为原料(粗蛋白含量50.47％),采用碱性蛋白酶(AlkalineProteause,Alcalase)水解制备了不同水解度的花生多肽。低度水解花生多肽:HD<15％；高度水解花生多肽:HD>15％。
高水解度花生多肽的最佳制备技术条件为:
加酶量75 U/g、酶解温度44.9～47.6℃、pH7.93～8.15、酶解时间2.46～2.76 h。所得花生蛋白最高水解度为19.61％,花生多肽得率为95.87％。花生多肽平均相对分子量(MW)为543.0,平均肽链长度(PCL)为5.10。其中可溶性短肽含量(TCA-NSI)占花生多肽总量的87.76％。
在上述基础上建立了低水解度花生多肽的制备技术。
通过高效液相色谱(HPLC)分析了花生多肽的分子量分布及氨基酸的组成和含量。花生多肽的分子量主要集中在3000以下,特别是分子量1000以下含量高达84.73％,这部分组分的平均相对分子量(MW)为543.0,平均肽链长度(PCL)为5.10。花生多肽超滤截留组分(MW3000)得率为86.79％,TCA-NSI为90.87％。分子量1000以下小肽混合物的含量升为90.53％。这部分组分的平均相对分子量(MW)为506.7,PCL为4.77。花生多肽氨基酸组成与花生蛋白相比,花生多肽的谷氨酸、精氨酸含量提高2.4％和4.1％,芳香族氨基酸含量也有增加(0.4％)。
2.不同水解度花生多肽生物活性的研究
2.1低水解度花生多肽生物活性的研究
低水解度花生多肽抑制血管紧张肽转化酶ACE活性的研究及其特定肽段序列CR-7的检测。首先采用高压液相色谱、质谱技术以及ACE生物活性抑制实验等对化学合成标样CR-7(氨基酸序列为Cys-Val-Thr-Pro-Ala-Leu-Arg)的化学特性和生物活性进行了表征。在此基础上运用分子生物学技术进行了多肽CR-7免疫抗原的合成,通过动物免疫制备了抗CR-7血清,采用Western印迹法、Dot blotting斑点杂交技术等,成功检测到花生蛋白、低度水解花生多肽中抑制ACE活性的特定肽段序列CR-7,并对其进行初步定量分析。
结果表明:花生分离蛋白的肽链中存在CR-7肽段序列,两条阳性反应带的分子量范围分别在18KD～25 KD、25KD～35 KD之间。花生多肽中CR-7特征肽段序列的相对含量高于花生蛋白中的含量,低度水解花生多肽中CR-7肽段序列的相对含量在HD>15％的范围内,存在先升高后降低的趋势,这趋势在一定范围内和花生多肽对ACE活性的抑制作用趋势相符,说明CR-7肽段序列在花生ACE抑制肽的研究中占有重要的地位。
2.2高水解度花生多肽体生物活性研究
2.2.1高水解度花生多肽体外抗氧化活性研究
本实验通过对羟自由基、红细胞溶血、肝脏与肝线粒体中的脂质过氧化以及肝线粒体肿胀度的测定,结果表明高度水解花生多肽能有效地清除羟自由基,抑制由羟自由基引起的脂质过氧化作用,在保护生物膜、减少红细胞溶血、减轻肝线粒体肿胀程度的作用方面,提示其具有很强的抗氧化能力。
分别运用邻苯三酚.鲁米诺、CuSO4-Phen-VC-H2O2和双氧水-鲁米诺化学发光体系测定了高度水解花生多肽对超氧阴离子、羟基自由基、体外双氧水的清除作用,采用CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA体系测定了花生多肽对体外DNA损伤的保护作用。实验结果表明高水解度花生多肽具有较好的体外清除活性氧和DNA损伤的保护作用。
2.2.2高水解度花生多肽对小鼠的免疫调节活性研究
动物实验结果表明,高度水解花生多肽能够增加小鼠的体重、脏器重量和脏器指数、免疫器官重量和指数。通过病理切片观察小鼠脾脏组织发现中、高剂量花生多肽(200mg/kg.d和400mg/kg.d)小鼠淋巴小结生发中心扩张,脾脏中网状细胞和浆细胞数目的体积和数量增加,这提示花生多肽有提高机体免疫的作用；花生多肽对胸腺没有明显的影响。
对动物进行分组实验,测定2,4-二硝基氟苯(DNFB)致敏的迟发性超敏反应、自然杀伤(NK)细胞活性和腹腔巨噬细胞吞噬功能,放射免疫分析(RIA)方法测定血清免疫球蛋白(IgG)含量,酶联免疫(ELLSA)方法测定白介素-1(IL-1)含量。结果表明:中、高剂量的花生多肽(200mg/kg.d和400mg/kg.d)能够调节迟发性超敏反应和NK细胞活性,增加IL-1和血清IgG的含量,提高腹腔巨噬细胞吞噬能力。这说明中、高剂量的花生多肽能提高机体的免疫能力。
2.2.3高水解度花生多肽抗突变活性的研究
应用经典的Ames试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞(Polychromatic erythrocytes,PCE)微核试验检测花生多肽的抗突变作用。研究结果表明:不同浓度的花生多肽对不同诱变剂诱导的不同Ames菌株回复突变无抑制作用,但其对环磷酰胺诱发的小鼠骨髓微核的发生有抑制作用,且呈剂量一效应关系。与致突变物环磷酰胺(Cy)对照组比较,200mg/Kg剂量组对Cy诱导的小鼠骨髓PCE微核形成的抑制率为33.79％,具有显著性(P<0.05)。由此可见,花生多肽对对诱变剂Cy所致的损害有一定的预防作用。
目前有关花生蛋白水解度的研究、低水解度花生多肽中抑制ACE活性及其特定肽段序列CR-7的检测以及高水解度花生多肽的抗氧化活性、免疫调节活性、抗突变作用等方面的系统研究结果均未见报道。
鉴于以上实验结果,表明花生蛋白水解产物的深度开发利用具有光明前途,因为这项研究符合国家关于建立资源节约型和环境友好型社会发展的大方向需要。