流行性感冒是一种很古老和首先实行全球性监测的传染病。2009年初开始肆虐全球的新型甲型H1N1流感给全球社会和经济发展带来灾难性打击,甲型H1N1流感是由甲型H1N1流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病,属中医瘟疫范畴。我国是流感频发国家,流感高危人群数量巨大,因此,做好充分的准备积极应对流感大流行对我国尤其重要。作为我国具有原创优势的中医药,在预防流感病毒方面有几千年的独特经验和方法,在“治未病”等先进的理论指导之下,中医积累了大量通过药物烟熏、佩戴及口服等方法预防流感的经验。但目前流感的中药预防并没有成熟的方案,科学评价中药预防流感的作用对于提高中医药预防传染病的水平和我国流感防治工作有非常积极的意义。本研究以芳香辟秽类制剂冰香散进行药效评价并探讨相关机制。目的：冰香散制剂是中医药中芳香辟秽的有效方,通过对冰香散体内体外防治甲1型流感病毒的实验研究,初步探讨冰香散不同给药方式防治流感病毒的作用机制。方法：1.药效评价：选用狗肾细胞(MDCK)将病毒接种于细胞上,通过体外试验研究,使用MTT法检测冰香散挥发油对甲1型流感病毒的治疗指数,观察比较冰香散在MDCK上对流感病毒FM1的预防、治疗和直接杀伤作用。1.1体内抗病毒研究使用滴鼻法用甲1型流感病毒FM1株感染NIH小鼠,观察冰香散雾化和滴鼻给药对甲1型流感病毒感染小鼠肺指数的影响及小鼠肺组织的病理变化。观察冰香散对流感病毒感染小鼠的死亡保护及延长生命率的影响。2.机制探讨：2.1冰香散防治对T淋巴细胞亚群的影响冰香散不同途径预防性给药7天,攻毒后继续给药5天,取脾制成单细胞悬液经流式细胞仪测定T细胞亚群。观察冰香散对CD4+、CD8+的百分率和CD4+/CD8+比值的影响。2.2冰香散防治关于黏膜免疫相关研究冰香散雾化与滴鼻给药对正常小鼠和流感病毒感染小鼠黏膜免疫相关指标的检测。共给药12天,其中流感病毒感染小鼠在给药后7天感染病毒,攻击病毒后再给药5天,收集血清、鼻咽冲洗液、支气管肺泡灌洗液、肠道冲洗液进行ELISA发检测IgA含量,并比较冰香散不同给药对黏膜免疫的相关影响。2.3冰香散防治对小鼠脾淋巴细胞因子的诱生和分泌的影响对正常NIH小鼠预防性给药14天,研究各组药物尤其是冰香散两种不同给药方式对正常NIH小鼠脾淋巴细胞因子诱生和分泌的影响。取脾制成单细胞悬液,细胞培养后用ConA诱导刺激并检测各组药物对IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ的影响。2.4冰香散防治给药对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响使用滴鼻法用甲1型流感病毒FM1株感染NIH小鼠,冰香散防治给药12天后,取脾制成单细胞悬液,细胞培养后分别用ConA和LPS刺激脾细胞增殖,48h后用CCK-8检测活细胞数,观察冰香散防治给药对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果：1.药效评价1.1体外抗病毒研究在体外试验中,冰香散挥发油对甲工型流感病毒有防治作用和直接抑制作用,而治疗作用不明显。在鸡红血球凝集法中,冰香散挥发油对甲Ⅰ型流感病毒的防治作用和直接抑制作用在最小实验浓度2.5μg/ml下仍然有较好的作用,能够完全抑制鸡红细胞的凝集,而其对甲Ⅰ型流感病毒的治疗作用不明显。在噻唑兰染色法中,冰香散挥发油防治作用和直接抑制作用的T1分别为5.89和2.02,初步显示出防治作用更强。1.2体内抗病毒研究冰香散挥发油雾化和滴鼻给药都显著降低了小鼠的肺指数,减轻了小鼠病毒性肺炎的症状及肺组织的病变程度,冰香散雾化、滴鼻给药组的肺指数抑制率分别为32.29%、25.46%,同时冰香散明显降低了小鼠的死亡率,延长了存活时间,表明受试药物可明显减轻和防治流感病毒所引起的小鼠肺炎症状,从而达到防治治疗和降低死亡率的目的。2.机制探讨：2.1冰香散防治对T淋巴细胞亚群的影响冰香散滴鼻组中CD4+T细胞和CD4+/CD8+比值跟模型组相比有明显的升高,说明冰香散通过滴鼻方式给药能起到一个调节T细胞亚群,维持免疫平衡,提高免疫力的作用；同样的药物冰香散,当采用雾化方式给药时,其结果与模型组无明显差别。2.2冰香散防治关于黏膜免疫相关研究冰香散挥发油雾化给药对正常小鼠血清IgA水平有明显的提升作用,对呼吸道及肠道黏膜IgA分泌的影响作用较弱；对流感病毒感染小鼠,除了提升血清IgA水平外,对下呼吸道黏膜及肠道黏膜的IgA分泌有明显的促进作用。冰香散滴鼻给药对正常小鼠呼吸道黏膜IgA分泌有明显的增加,但对肠道黏膜分泌IgA无明显作用,对流感病毒感染小鼠鼻咽部黏膜的IgA分泌有明显的提升作用,但对下呼吸道及肠道黏膜IgA分泌作用不明显。2.3冰香散防治对小鼠脾淋巴细胞因子的诱生和分泌的影响从IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-2的实验结果上看,冰香散挥发油的不同给药对相关细胞因子的影响不同。滴鼻给药抑制了TNF-α水平,而病毒感染小鼠的TNF-α水平会明显上升,这也许就是冰香散抗流感病毒作用机制之一。雾化给药提高了IL-4和IFN-γ的分泌,改善机体的免疫功能,减轻机体的损害症状。从功能作用上看,IL-4具有双重作用,既可以抑制TNF-α的分泌又可以提高机体的免疫力。2.4冰香散防治给药对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响冰香散滴鼻能一定程度上促进LPS刺激诱导小鼠脾B淋巴细胞的增殖作用,而冰香散雾化对LPS刺激诱导小鼠脾B淋巴细胞的增殖作用起负调控作用。冰香散雾化能促进ConA刺激诱导小鼠脾T淋巴细胞的增殖作用,而冰香散滴鼻对ConA刺激诱导小鼠脾T淋巴细胞的增殖作用不明显。可见,冰香散滴鼻给药可能针对的是机体体液免疫在病毒感染前期发挥着抗病毒作用,而冰香散雾化给药可能针对的是机体的细胞免疫在病毒侵染到寄主细胞后发挥抗病毒作用。结论：冰香散两种不同给药方式虽然抗病毒的作用机制不同,但都有很好的抗病毒功效,在临床上都有很好的市场前景。冰香散的使用可以根据患者的需要进行选择,成年人可以使用滴鼻给药,滴鼻给药不仅起效快速而且方便宜施,能大大节约时间提高患者的医从性。但是,对未成年儿童不易使用滴鼻给药,相比而言,使用雾化给药能减少患儿的不适感,大大提高儿童的医从性。可见冰香散挥发油制剂在未来的防治流感道路上有着得天独厚的优势,市场前景可观,有必要将其研究进行到底。