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杧果细菌性角斑病是一种严重危害杧果的细菌性病害,由柑橘黄单胞菌杧果致病变种(Xanthomonas critis pv.mangiferaeindicae,Xcm)引起。植物病原细菌分泌产生的细胞壁降解酶能够破坏寄主表皮细胞,帮助病原细菌侵入植物组织,是病原细菌的一个重要致病因子。本课题组前期研究发现,Xcm在侵染杧果或自然发酵培养过程中可产生多种细胞壁降解酶。为进一步明确细胞壁降解酶在Xcm侵入过程中的作用,本研究通过同源克隆对Xcm的cel、xyl1、xyl2和xynA四个基因进行了克隆,并进行了生物信息学预测,通过qRT-PCR技术对这四个基因在侵入杧果叶片前后的表达量变化进行了分析,并对xyl1、xy12和xynA三个基因做了原核诱导表达分析等研究,结果如下:1.利用同源克隆技术克隆得到Xcm的cel、xyl1、xyl2和xynA基因,经测序并确认后运用多种生物信息学软件分析,对这些蛋白的序列特征和功能结构进行了初步分析。经系统发育树分析,得到Xcm的这四个基因在不同种属间都具有高度的氨基酸序列保守性,分别与 X.citri pv.punicae str.LMG 859(CCF67690.1)、X.campestris pv.centellae(OOW50899.1)、X axonopodis pv.melhusii(OOW66465.1)和 X.citri pv.glycines(OEY88849.1)的亲缘关系最近。2.为了更好的分析cel、xyl1、xy12和xynA基因在侵染杧果过程中的表达量,从Xcm基因组中选取16s rRNA、gyrB、GAPHD、danK和rpoD这5个管家基因为候选内参基因。用qRT-PCR法对这5个内参基因在Xcm侵入杧果叶片前后的表达量进行稳定性综合评价分析。结果表明:在侵入前叶片表面的样品中,最适合的组合为gyrB、GAPHD和rpoD 3个内参基因,而侵入后叶片组织中的样品中,最适合内参基因组合为 gyrB 和 GAPHD。3.通过qRT-PCR对cel、xyl1、xyl2和xynA四个基因在Xcm侵入杧果叶片前后的表达水平并根据筛选出的内参组合进行分析。在Xcm侵入杧果叶片前,这四个基因在此过程中均持续高效表达。cel基因的表达趋势为逐渐上升,在第72 h表达量最大;xyl1基因的表达量趋势为逐渐上升至第12 h表达量最大,后在第48 h处再有一个小高峰;xyl2基因表达量逐渐上升至第48 h最大,随后降低;xynA基因表达量逐渐上升至12 h处后稍降低,再次上升至48 h处最大表达量后降低。在Xcm侵入杧果叶片组织后,这四个基因在此过程中均持续高效表达,分别在第6 h、3 h、24 h和3 h表达量最大。由此推测,这四个基因在Xcm侵入前后的不同时间段均发挥着不同的作用。4.利用原核表达载体pET-32a分别连接去除信号肽的xyl1、xyl2和xynA三个基因,成功将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG诱导法进行蛋白表达。经SDS-PAGE检测,诱导出的蛋白均在主要沉淀中,大小分别为70 kD、70 kD和45kD,说明这三个诱导出的蛋白均为包涵体,无酶活性。并筛选出了这三蛋白的最适的诱导培养基、温度、IPTG诱导浓度和取样时间。