电针结合人胚胎间充质干细胞移植对酒精性肝纤维化模型大鼠干预的研究研究目的复制并改良持续酒精灌胃法制备酒精性肝纤维化模型大鼠,分别采用电针经穴、筋膜并结合人胚胎间充质干细胞(human embryonic mesenchymal stem cells, hEMSCs)移植干预,观察分子生物学相关指标的变化,比较电针经穴、筋膜对hEMSCs在酒精性肝纤维化模型大鼠体内靶向迁移轨迹的影响,综合评价电针经穴、筋膜结合hEMSCs移植对酒精性肝纤维化模型大鼠的疗效及其差异,并通过模型大鼠血清、电针血清体外诱导培养hEMSCs,进一步探讨电针诱导hEMSCs分化的可能机制,初步阐明电针对干细胞移植抗肝纤维化治疗具有促进增效作用,为指导临床开展针刺结合干细胞移植抗酒精性肝纤维化治疗以及针灸与筋膜效应差异的研究提供实验与理论依据。研究方法1将102只健康雄性SD大鼠按体重随机分为A(正常对照组)、B(模型组)、C(hEMSCs移植组)、D(电针期门+hEMSCs移植组)、E(电针期门穴区筋膜密集区+hEMSCs移植组)、F(电针阳陵泉+hEMSCs移植组)、G(电针阳陵泉穴区筋膜密集区+hEMSCs移植组)7组,采用改良的白酒—猪油(自制)—吡唑混悬液持续灌胃60d复制酒精性肝纤维化模型；2含10%胎牛血清(FBS)的DMEM(低糖)培养基常规培养、传代扩增hEMSCs至第6代细胞,采用重组腺病毒载体Ad5-EGFP转染hEMSCs(感染复数为100)48h后,常规消化细胞并计数,根据细胞计数结果加入PBS缓冲液,将已转染的hEMSCs调成浓度为2×106cells/ml的单细胞悬液,于无菌条件下对C、D、E、F、G五组造模成功的大鼠进行尾静脉注射移植,0.5ml/只；3 D、E、F、G四组(电针治疗组)分别采用电针双侧期门穴、期门穴区筋膜密集区、阳陵泉穴、阳陵泉穴区筋膜密集区,疏密波,频率2/1 OOHz,强度0.1～0.2mA,以肢体微微颤动为度,留针20min,隔24h治疗1次,共治疗10次。同时A、B、C三组分别予以布袋束缚20min不针刺；4观察大鼠的体重变化及毛色、进食、活动等一般情况,采用酶联免疫分析(ELLSA)方法测定各组大鼠血清胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、Ⅳ型胶原、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)的含量,采用激光共聚焦技术观察肝组织冰冻切片Ad5-EGFP转染的hEMSCs在酒精性肝纤维化模型大鼠体内向肝脏靶向迁移的轨迹,肝组织常规石蜡切片行HE、天狼猩红染色观察胶原沉积情况及病理学变化,免疫组织化学法测定肝组织中TGF-p1、TNF-a的表达；5通过酒精性肝纤维化模型大鼠血清及电针血清不同时间段诱导培养hEMSCs,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测不同血清干预诱导后甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、白蛋白(Albumin,ALB)及α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的基因表达。研究结果1正常对照组大鼠毛发光泽,体重增加,体态活泼,饮食及大、小便正常。模型组大鼠饮食逐渐减少,体重减少,大便干燥或不成形,气味恶臭,小便黄,皮毛粗糙、疏松无光泽,脱毛明显,精神萎靡不振,造模后狂躁易怒,有互相撕咬等好斗现象。电针各组大鼠治疗后上述症状有不同程度改善。2各组大鼠血清IGF-Ⅰ、Ⅳ型胶原、MMP-2、TIMP-1含量的变化与正常组比较,模型组大鼠血清IGF-1、Ⅳ型胶原及MMP-2含量均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05,P<0.01),hEMSCs移植组大鼠血清Ⅳ型胶原与MMP-2含量明显升高、TIMP-1含量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01),电针阳陵泉穴筋膜密集区+hEMSCs移植组大鼠血清TIMP-1含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较,hEMSCs移植组大鼠血清TIMP-1含量降低显著,差异有统计学意义(P<0.01),电针期门穴筋膜密集区+hEMSCs移植组大鼠血清IGF-1含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),电针阳陵泉穴+hEMSCs移植组大鼠血清Ⅳ型胶原含量降低显著,差异有统计学意义(P<0.05),电针阳陵泉穴筋膜密集区十hEMSCs移植组大鼠血清IGF-1、MMP-2、TIMP-1含量均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05,P<0.01)；与hEMSCs移植组比较,电针期门穴+hEMSCs移植组大鼠血清Ⅳ型胶原含量明显降低、TIMP-1含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),电针期门穴筋膜密集区+hEMSCs移植组大鼠血清IGF-1、Ⅳ型胶原、MMP-2含量均降低明显,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01,P<0.05),电针阳陵泉穴+hEMSCs移植组与阳陵泉穴筋膜密集区+hEMSCs移植组大鼠血清Ⅳ型胶原、MMP-2含量均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与电针期门穴+hEMSCs移植组比较,电针阳陵泉穴筋膜密集区+hEMSCs移植组大鼠血清TIMP-1含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。电针各组大鼠血清IGF-1、Ⅳ型胶原、MMP-2含量比较则均未见显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。3携带Ad5-EGFP基因的hEMSCs在酒精性肝纤维化模型大鼠体内向肝脏靶向迁移的情况相同视野下,hEMSCs移植组大鼠肝组织可见极少量绿色荧光,而电针各组大鼠肝内亦可见散在绿色荧光,但较单纯hEMSCs移植组内的分布增多。肾中均未见分布。4 HE染色显示：正常对照组大鼠肝小叶结构清晰,肝细胞索排列整齐,呈放射状,肝窦规则,细胞结构清晰,胞质散见脂滴；模型组大鼠肝小叶结构紊乱或不完整,肝细胞肿胀、重度脂肪变性、中央静脉周围胶原纤维增生,汇管区纤维隔增宽；各治疗组肝组织变性、坏死较模型组有所减轻,胶原纤维增生减少,部分肝小叶结构有所恢复。天狼猩红染色显示,与正常组比较,模型组大鼠肝组织胶原沉积面积明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较,电针期门穴筋膜密集区+hEMSCs移植组与阳陵泉穴+hEMSCs移植组大鼠肝组织胶原沉积均显著减少,差异有统计学意义(P<0.01),余未见统计学意义(P>0.05)。5免疫组化结果显示,与正常组比较,模型组、hEMSCs移植组与电针各组大鼠肝组织TGF-p1、TNF-a阳性细胞表达均有所增加(P>0.05)；与模型组比较,hEMSCs移植组与电针各组大鼠肝组织TGF-p1、TNF-a阳性细胞表达均有所减少(P>0.05)；与hEMSCs移植组比较,电针各组大鼠肝组织TGF-p1、TNF-a阳性细胞表达均呈现一定程度的减少(P>0.05)。电针各组间比较,大鼠肝组织TGF-p1、TNF-a阳性细胞表达分别表现为一定程度的减少或增加(P>0.05)。6 RT-PCR检测结果显示,培养24h时,各诱导组细胞均未见AFPmRNA、ALBmRNA及a-SMA mRNA表达；培养5d时,除针刺阳陵泉筋膜鼠血清组外各诱导组AFPmRNA表达均呈阳性,且酒精性肝纤维化模型鼠血清组与针刺阳陵泉穴鼠血清组少许细胞呈a-SMA mRNA弱阳性,针刺期门筋膜鼠血清组与针刺阳陵泉穴鼠血清组有少数细胞呈ALBmRNA阳性；随培养时间延长,除针刺阳陵泉筋膜鼠血清组在培养14d部分细胞呈AFPmRNA阳性,余各诱导组AFPmRNA表达逐渐减弱,ALBmRNA表达逐渐增强。整个培养过程对照组细胞AFPmRNA、ALBmRNA及a-SMA mRNA表达呈阴性。研究结论1改良后的白酒—猪油(自制)—吡唑混悬液持续灌胃法可使大鼠肝组织较快出现重度脂肪变,进而导致肝纤维化的发生,发病过程与人类酒精性肝纤维化发病过程相似,且模型制备时间缩短,模型成活率较高,方法简便易行；2 hEMSCs移植对酒精性肝纤维化具有一定的改善作用,其机制可能与hEMSCs移植进入酒精性肝纤维化模型大鼠体内后受内环境影响部分细胞向肝脏定向迁移分化,并有效降低了肝纤维化模型大鼠血清TIMP-1含量,一定程度上减少了TGF-p1、TNF-a在肝纤维化模型大鼠肝组织中的高表达有关。3电针结合hEMSCs移植具有明显的抗肝纤维化作用,其疗效的产生可能是通过降低酒精性肝纤维化模型大鼠血清中升高的IGF-Ⅰ、Ⅳ型胶原、MMP-2、TIMP-1含量,改善肝纤维化导致的肝细胞变性、坏死程度,抑制胶原纤维增生及病变肝组织中TGF-β1、TNF-a的高表达,同时电针在一定程度上还促进了hEMSCs向病变肝组织的靶向迁移、分化而实现的。推测其机制可能与电针在一定条件下改变了病变局部的微环境,使其向着有利于干细胞向病损组织靶向迁移、分化的方向发展有关。这个一定条件包括实验中所涉及的针刺穴位选择、电针强度、电针频率等。4电针不同经穴、不同经穴筋膜密集区疗效不同：阳陵泉穴的疗效>期门穴,阳陵泉穴区筋膜密集区与期门穴区筋膜密集区疗效无明显差异；期门穴区筋膜密集区的疗效>期门穴,阳陵泉穴的疗效>阳陵泉穴区筋膜密集区。5酒精性肝纤维化病理模型血清和电针血清均能够诱导hEMSCs分化为肝细胞样细胞,并表达肝细胞的特异性标志物AFP、ALB,且电针血清诱导hEMSCs分化的速度较快、肝细胞特异性标志物的表达更强,推测模型血清及电针血清中可能存在诱导hEMSCs分化为肝细胞样细胞的相关因子,且针刺可能为hEMSCs向肝细胞分化提供了更适宜的诱导环境,缩短了hEMSCs向肝细胞分化的时间,进而发挥抗肝纤维化作用的。且针刺期门穴区筋膜密集区组与阳陵泉穴组诱导效果最明显。综上所述,本研究结果对今后临床开展针刺结合干细胞移植治疗酒精性肝纤维化患者具有重要的指导意义,并为针灸的筋膜学基础研究提供了宝贵的实验依据。