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cAMP受体蛋白CRP是一类极为重要的转录调控因子。在仅需与其DNA靶位点结合和RNA聚合酶(RNAP)相互作用的情况下,CRP就能发挥对靶基因表达的调控作用。通常来说,cAMP是CRP的主要效应分子。在大肠杆菌(Escherichia coli)中,CRP在总体上控制了糖及氨基酸的转运及代谢过程;在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中,CRP家族蛋白VFR参与了宿主相关的毒性因子的表达调控(如类型Ⅲ分泌系统和外毒素A的产生)及鞭毛的合成等。在土壤微生物恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因组中,同样存在一个crp同源基因,但对其编码产物的性质和功能却鲜有报导。本论文对恶臭假单胞菌CRP的信号感应特性及功能进行了深入的研究。 本工作首先证明在大肠杆菌中,恶臭假单胞菌CRP(PpCRP)能回补因crp缺陷而丧失的lac启动子活性,且这种回补效应有依赖于或不依赖于cAMP两种机制。体外凝胶阻滞实验结果表明,PpCRP能在cAMP存在下结合lac启动子序列。将纯化后的PpCRP蛋白进行胰蛋白酶消化反应后发现,有cAMP结合的蛋白与无cAMP结合的蛋白相比更易遭到蛋白酶的攻击。因此,结合cAMP后PpCRP应该发生了相应的构象变化,以使其更容易结合上靶DNA序列,这与大肠杆菌 CRP(EcCRP)所具有的协同效应相近。此外,cGMP也被证明能够诱导恶臭假单胞菌CRP的lac启动子结合和激活功能,但胰蛋白酶消化实验并未观察到明显的cGMP结合诱导的PpCRP构象改变。 体外ITC实验表明,PpCRP对cAMP有着更强的亲合性,相比于EcCRP有着约两个数量级的增加。PpCRP对于cGMP的结合能力也比EcCRP高出一个数量级。随后的结构模拟分析也表明,PpCRP与EcCRP有着相似的N端cNMP结合域和C端HTH DNA结合序列。这些连同ITC测量的竞争性实验表明cAMP及cGMP都能结合在PpCRP的cNMP结合位点并发挥作用。 本文还利用定点突变对造成PpCRP异常信号感应能力的分子机制进行了研究。结果表明,PpCRP序列上明显的冗余氨基酸残基Pro79、Va180和Glu83对其与配体的结合没有影响,与DNA结合的HTH结构域上的Met186等残基也未被发现能影响蛋白的启动子激活能力。一个处于cNMP结合域中与配体相互作用的氨基酸残基Thr132是造成PpCRP上述特性的主要因子。将此位点Thr突变成Ser(EcCRP相应位点氨基酸残基)后,PpCRP突变体蛋白表现出与EcCRP相同的配体结合能力,尽管它的启动子激活能力大大下降。进一步的生物信息学分析表明,此位点在γ变形菌CRP类似蛋白中具有高度的保守性,Thr及Ser是两种最主要存在的氨基酸残基。例如,铜绿假单胞菌PaVFR的Thr132对其cAMP或cGMP诱导的启动子激活能力也表现出类似的关键作用。 综上所述,本研究证明了恶臭假单胞菌CRP具有与其大肠杆菌同源蛋白类似的转录调控因子功能。它对配体cAMP表现出异常高的结合能力,对cGMP也有一定的感应效应。Thr132对其信号感应能力有着关键的影响。这些研宄成果对继续深入探索其它种类繁多的CRP蛋白特性具有一定的指导意义。