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研究背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜炎症和关节结构破坏为特征的慢性炎症性疾病，致残率高，是造成我国人群劳动力丧失和致残的主要疾病之一。延缓甚至阻断RA病人的骨质破坏已成为RA治疗的重要目标之一。 近年研究表明:(1)细胞因子网络在RA的发病机制中起着重要作用，是RA病变持续存在、迁延进展的关键因素。(2)核因子κB受体活化因子配体(receptor activator ofNF-κB ligand，RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)系统介导的破骨细胞增殖活化是RA关节炎病灶骨侵蚀进展的关键。(3)新骨形成减少，进一步加重RA骨代谢失衡。在RA的关节炎症局部，由于成骨细胞的成熟和功能受损，局部新骨形成也存在缺陷。最新的研究发现成骨细胞的增殖活化主要依赖于Wnt信号通路的调节，DKK-1则是Wnt信号通路的抑制因子。 新近的研究结果表明99Tc-MDP可以缓解RA的关节疼痛、肿胀，降低炎性指标。还可修复晚期RA患者的骨质破坏，改善关节间隙。但具体作用机制尚不清楚，尤其是锝、MDP单一成分或两种成分的螯合物对RA骨侵蚀起作用尚缺乏研究。 本研究拟选用SD大鼠和RA患者原代滑膜细胞为主要材料，以胶原诱导性关节炎和TNF-α刺激滑膜细胞诱导炎症作为主要模型，采用ELISA, Real Time-PCR，免疫组化等研究手段从整体、细胞及分子水平观察99Tc-MDP对类风湿关节炎骨侵蚀的治疗作用，探讨其有效作用成分及可能的作用机制。开展本项目研究，可望阐明99Tc-MDP对类风湿关节炎骨侵蚀的治疗作用及其具体机制，为临床应用99Tc-MDP治疗RA提供实验依据。 第一部分99Tc-MDP对胶原诱导性关节炎骨侵蚀的影响 目的:探讨99Tc-MDP对胶原诱导性关节炎骨侵蚀的保护作用及最低起效剂量。 方法:SD大鼠46只，随机选取6只作为正常对照组，40只建立CIA大鼠关节炎模型，分为以下4组，模型组:注射等体积的生理盐水。99Tc-MDP低剂量组:尾静脉注射99Tc-MDP1mg/kg.d，共14天。99Tc-MDP中剂量组:尾静脉注射99Tc-MDP2mg/kg.d，共14天。99Tc-MDP高剂量组:尾静脉注射99Tc-MDP4mg/kg.d，共14天。肉眼观察足肿胀并进行关节炎指数(arthritis index，AI)评分，放射学和组织病理学对骨质破坏进行评分。 结果: 1.99Tc-MDP对CIA大鼠的骨侵蚀有显著的保护作用。与模型组相比，99Tc-MDP可以减轻CIA大鼠的关节肿胀，降低放射学评分和组织病理学评分。 2.与99Tc-MDP低剂量组相比，99Tc-MDP高、中剂量组关节肿胀均较轻:关节炎指数、放射学评分和组织病理学评分显示高、中剂量组的关节破坏程度均低于低剂量组。 结论: 99Tc-MDP对CIA大鼠的骨质破坏具有抑制和保护作用，其最低起效剂量为2mg/kg。 第二部分99Tc-MDP治疗胶原诱导性关节炎骨侵蚀的有效成分研究 目的:探讨99Tc-MDP治疗胶原诱导性关节炎骨侵蚀的有效成分。 方法:建立CIA大鼠关节炎模型，分为以下4组，模型组:注射等体积的生理盐水;帕米磷酸二钠组:静脉注射帕米磷酸二钠3.125mg/kg.d;MDP组:予尾静脉注射MDP2mg/kg.d，共14次;99Tc-MDP组:尾静脉注射99Tc-MDP2mg/kg.d，共14次。肉眼观察足肿胀并进行关节炎指数(arthritis index，AI)评分，放射学和组织病理学对骨质破坏进行评分，放射学评分采用Larsen评分标准。 结果: 1.99Tc-MDP、帕米磷酸二钠及MDP对CIA大鼠的骨侵蚀均有治疗作用。与模型组相比，各药物治疗组的关节炎指数和放射学评分显著降低;组织病理学评分显示各组药物治疗可以不同程度的减轻CIA大鼠骨质破坏; 2.与帕米磷酸二钠和MDP组相比，99Tc-MDP组关节肿胀较轻，关节炎指数和放射学评分较低，骨质破坏程度亦较轻。 结论: 99Tc-MDP、帕米磷酸二钠及MDP对CIA大鼠的骨侵蚀均有治疗作用，帕米磷酸二钠及MDP治疗骨侵蚀的疗效相当。99Tc-MDP对骨侵蚀的疗效明显优于MDP组，说明99Tc与MDP的螯合物疗效优于其单一成分。 第三部分99Tc-MDP治疗RA骨侵蚀的机制研究 目的:观察99Tc-MDP对CIA大鼠和类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA FLS) RANKL、OPG、DKK-1表达和释放的影响，探讨99Tc-MDP治疗RA骨侵蚀的可能机制。 方法:1.建立CIA大鼠关节炎模型，分别用高剂量(4mg/kg)、中剂量(2mg/kg)、低剂量(1mg/kg)治疗CIA大鼠，模型组注射等体积的生理盐水。第29天处死所有大鼠，心脏采血，ELISA法检测血清RANKL、OPG、DKK-1水平，免疫组化检测关节区RANKL、OPG、DKK-1的表达，Real time-PCR检测滑膜中RANKL、OPG、DKK-1 mRNA的表达。 2.建立RA FLS的体外培养体系，用TNF-α刺激并与不同浓度99Tc-MDP共同孵育，MTT法检测99Tc-MDP对RA FLS增殖的影响;ELISA测定RANKL、OPG、DKK-1的水平;Real Time-PCR检测99Tc-MDP对活化后RA FLS表达RANKL、OPG、DKK-1的影响。 结果: 1.高、中剂量99Tc-MDP能显著降低CIA大鼠血清中RANKL和DKK-1的水平，增加OPG的水平;还能抑制关节区及滑膜组织中RANKL、DKK-1蛋白和mRNA的表达，促进OPG的表达。 2.MTT结果显示99Tc-MDP可以抑制TNF刺激的RAFLS过度增殖，台盼蓝染色证实这种抑制作用不是由药物的毒性作用所致。99Tc-MDP可抑制TNF-α诱导的RA FLS RANKL、DKK-1的分泌和mRNA的表达，并呈剂量依赖性;可促进TYF-α诱导的RA FLS OPG的分泌和mRNA的表达，并呈剂量依赖性。 结论: 1.99Tc-MDP可降低RANKL的表达，促进OPG表达。从而抑制骨侵蚀的进展; 2.99Tc-MDP能抑制DKK-1的表达，从而可能解除对Wnt信号通路的抑制，促进成骨细胞的增殖与功能。