【摘 要】
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启动子在基因表达调控过程中发挥着重要的作用,对启动子的克隆及功能研究有助于深入了解基因表达调控模式及与之互作的转录因子。花药/花粉特异性启动子能够驱动干扰花粉产生、活力或释放的基因在雄蕊中特异、高效的表达,是运用基因工程技术创建雄性不育的重要途径之一。本研究克隆和分析了花药特异性基因PhLRR的启动子序列,同时构建其5′端缺失突变载体进行遗传转化来分析启动子上的顺式作用元件;此外,将启动子与Bar
【基金项目】
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国家自然科学基金； 华中农业大学自主创新项目；
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启动子在基因表达调控过程中发挥着重要的作用,对启动子的克隆及功能研究有助于深入了解基因表达调控模式及与之互作的转录因子。花药/花粉特异性启动子能够驱动干扰花粉产生、活力或释放的基因在雄蕊中特异、高效的表达,是运用基因工程技术创建雄性不育的重要途径之一。本研究克隆和分析了花药特异性基因PhLRR的启动子序列,同时构建其5′端缺失突变载体进行遗传转化来分析启动子上的顺式作用元件;此外,将启动子与Barnase毒性基因融合转化矮牵牛,对启动子功能进行了分析。主要研究结果如下:1.PhLRR启动子克隆和序列分析。通过PCR技术从‘幻想’矮牵牛基因组DNA中克隆到1254 bp的PhLRR基因启动子,利用PLACE和Plant CARE数据库对启动子序列进行分析发现,启动子序列中含有大量花药特异性顺式作用元件和转录调控元件,预测PhLRR启动子具有花药特异性,受Dof蛋白和光的调控。2.PhLRR启动子5′端缺失载体的构建及遗传转化。成功构建4个PhLRR启动子5′端缺失突变体融合GUS报告基因的载体pPhLRR::GUS、pPhLRR-1003::GUS、pPhLRR-616::GUS和pPhLRR-368::GUS并转化早花烟草,分别得到19、21、20、16株转基因阳性植株。GUS染色结果表明PhLRR启动子-1254～-1004 bp区域存在增强子元件,能够增加下游基因的表达量;-1003～-617bp区域控制PhLRR启动子的花药特异性,该区段的消失会使启动子丧失花药特异表达活性,同时该区段还含有抑制子,抑制基因在根,茎,叶和萼片中的表达;-616～-368 bp是含有启动子基本元件的关键区段。3.pPhLRR::Barnase载体的构建及遗传转化。构建了pPhLRR::Barnase载体转化‘W115’矮牵牛,获得23株阳性株系。转基因植株表型如下:T0和T1代植株花药显著变小;花粉粒明显变小,表面光滑,缺失萌发沟、萌发孔和纹饰等外壁结构;进一步研究表明PhLRR启动子具有时空特异性,其驱动Barnase基因在小孢子发育期的绒毡层中表达,造成绒毡层降解,导致花粉败育;柱头活性正常,其它花器官大小和形态均没有显著变化。RT-PCR分析发现PhLRR启动子只在花药中具有活性,在其它花器官和组织中均没有表达。
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