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本论文以乳酸脱氢酶(LDH)为模式蛋白,研究了化学修饰剂对酶的多重作用。结果表明化学修饰剂除了能够导致酶的失活,获得酶的催化位点的有用信息外,还能导致酶的解聚和去折叠,其作用类似于弱变性剂。本文研究了化学修饰剂OPTA对LDH的活性、聚合状态和构象的影响。OPTA处理导致LDH的失活、解聚和去折叠,并且出现了去折叠中间体。对失活和构象变化过程进行比较显示酶的活性中心比酶分子本身具有更大的柔性。本文还采用另一个化学修饰剂pCMB处理LDH,仍然观察到了类似现象。经过pCMB处理的LDH发生失活和部分去折叠。此外,在NativePAGE还捕捉到了去折叠中间体。上述结果表明,化学修饰剂对LDH具有多重作用,可以引起它的失活、解离和去折叠。
本文研究了LDH在SDS溶液中的失活和去折叠。结果表明SDS的变性作用和化学修饰剂的作用类似。同时,在SDS导致LDH变性过程中捕捉到了去折叠中间体,结合上述研究和前人的研究结果,完善了LDH的去折叠路径为:T-2D-4M*-4M-4U。
本文研究了N末端缺失对LDH结构和功能的影响。LDH的N末端氨基酸序列对于其聚合以及结构稳定具有重要的作用。但是迄今为止,还没有人采用N末端缺失的手段来研究这段氨基酸序列在LDH中的作用。本论文工作采用分子生物学的手段,构建了N末端缺失的LDH突变体,并且摸索了分离纯化条件,获得了突变体。
通过比较重组原酶和N末端缺失突变体的性质,发现N末端缺失突变显著影响LDH的活性,但是在有稳定结构的盐类如硫酸铵存在的条件下,突变体的活力能够部分恢复。此外,N末端缺失突变还能显著影响LDH的稳定性,导致其对各种变性条件诸如酸、热和盐酸胍变性的敏感性增加。突变体容易去折叠,再折叠能力降低,且缺失的数目越多,这种变化越明显。总之,N末端缺失显著影响LDH活性和结构稳定性,说明N末端在维持LDH的空间结构上起着重要的作用。这些研究为进一步研究寡聚酶的亚基相互作用打下了基础。