研究目的:重金属污染是指由重金属或其化合物造成的环境污染。主要由采矿、化学工业、金属冶炼、废气排放、污水灌溉等人为因素所致。重金属污染主要存在于水体,还有一部分是在大气和固体废物中。汞离子(Mercury ions,Hg2+)污染是重金属污染最常见的类型之一。环境中的Hg2+可经由食物链进入人体,并在脑、肝、肾等组织内蓄积,引起全身中毒作用。有研究表明,人体摄入Hg2+可以影响细胞内线粒体、内质网、细胞核等组成成分,产生细胞毒性,引发代谢异常,从而导致人体多种疾病的产生。因此,发展快速、实时、可视化检测细胞内Hg2+的新方法,对于防控Hg2+污染是非常重要的。近年来,研究者们利用具有特异性识别功能的核酸链（DNA）,为快速检测Hg2+提供了新的发展方向。基于胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶(Thymine-Hg2+-Thymine,T-Hg2+-T)错配结构设计的传感策略用于Hg2+的检测,展现出良好的特异性和灵敏度。因此,本研究利用富T链（T20）和锆金属有机框架（ZrMOFs）,结合荧光共振能量转移过程,设计荧光信号由“关”到“开”的纳米荧光探针,建立该探针在Hg2+暴露的细胞内成像检测方法。为实现快速、实时、可视化的重金属离子检测提供新的策略和实验依据。研究方法:1.Zr-MOFs纳米材料的制备与表征以对苯二甲酸和氯化锆为原料通过油浴加热制备尺寸均一的ZrMOFs。采用X射线衍射、Zeta电位仪、扫描电子显微镜等技术对ZrMOFs的尺寸、形态和其表面电荷等进行表征。2.T20/A10-Zr-MOFs荧光探针的制备与表征将AMCA荧光基团标记的DNA1（T20）和Dabcyl猝灭基团标记的DNA2（A10）通过“加热-冷却”过程形成T20/A10杂交双链,作为Hg2+的识别传感元件。将T20/A10与Zr-MOFs共孵育,通过DNA磷酸骨架和锆不饱和位点的结合、π-π堆叠以及DNA和Zr-MOFs之间的静电吸附等作用力,T20/A10成功固载至Zr-MOFs表面,形成T20/A10-Zr-MOFs荧光探针。采用X射线衍射仪、Zeta电位仪、扫描电子显微镜等技术对它的尺寸、形态和DNA固载效率等进行表征。3.PO43-竞争结合机制的可行性研究利用荧光光谱、微量紫外分光光度计对磷酸基团(PO43-)与DNA磷酸骨架竞争结合锆不饱和位点以释放DNA的能力进行体外验证。4.所构建纳米荧光探针的实验条件优化利用荧光光谱对纳米荧光探针的材料浓度、双链比例和识别时间进行优化。5.构建纳米荧光探针的响应性能验证利用荧光光谱对所构建荧光探针的特异性和稳定性进行评估。6.标准曲线的绘制。利用荧光光谱仪检测所构建探针对不同浓度Hg2+的响应荧光信号,绘制标准曲线。7.细胞内Hg2+荧光成像体外培养Hela细胞,采用CCK8实验评价不同浓度Zr-MOFs和Hg2+的细胞毒性。通过建立Hg2+暴露的细胞模型,利用激光扫描共聚焦显微镜观察纳米荧光探针在细胞内的荧光信号强度变化,进一步检测该探针在细胞内识别Hg2+的能力。研究结果:1.合成的Zr-MOFs纳米材料溶液呈透明、乳白色。扫描电子显微镜结果显示Zr-MOFs呈均匀、单一的“八面体”结构,平均粒径为195.6nm。Zeta电位仪检测发现其表面带有正电荷,证实存在锆不饱和位点。合成的Zr-MOFs的X射线衍射（XRD）图谱与标准Zr-MOFs的XRD图谱特征峰一致,表明Zr-MOFs合成成功。2.T20/A10-Zr-MOF荧光探针的XRD图谱在8°和26°左右的特征峰没有观察到明显改变,说明DNA固载到Zr-MOFs表面后,对ZrMOFs的形态、结构未产生明显影响。Zeta-potential的结果显示与ZrMOFs带正电荷不同,T20/A10-Zr-MOFs荧光探针带负电荷。提示带负电荷的T20/A10杂交双链成功固载到Zr-MOFs表面,引起纳米载体表面电荷发生变化。根据荧光光谱结果,通过公式F0-F/F0计算得到双链固载率约为63%左右,证明DNA磷酸骨架与锆不饱和位点相结合使DNA固载到Zr-MOFs表面的策略是可行的。3.荧光光谱检测结果显示在PBS缓冲溶液作为介质时,随着Hg2+的加入,其荧光信号明显升高,说明PBS缓冲溶液中存在的PO43-可以与T20/A10的磷酸骨架竞争结合锆不饱和位点,使T20/A10从ZrMOFs表面游离出来发挥作用。游离的T20/A10在Hg2+存在时,更倾向形成T-Hg2+-T错配结构,引起双链解离,导致荧光信号升高。微量紫外分光光度计的检测结果也表明T20/A10由于PO43-竞争结合锆不饱和位点游离到上清液中,导致上清液中T20/A10浓度明显增加。以上实验证明了PO43-与DNA磷酸骨架竞争结合锆不饱和位点以释放DNA进入细胞这一策略可行。4.荧光光谱结果显示合成荧光探针的材料最佳浓度为100μg/m L,最佳双链比例为1.5。该探针的最佳Hg2+识别时间为20分钟。5.荧光光谱结果表明该纳米荧光探针能特异性识别Hg2+,可以抵抗其它干扰性阳离子的作用,特异性佳。且4小时内该探针稳定性较好,可以满足Hg2+识别的要求。6.测定其标准曲线发现该纳米荧光探针的荧光信号强度与Hg2+的浓度呈线性相关,得到线性回归方程式Y=3.4165X+3520.7（R2=0.9927）。7.CCK8实验结果表明,在不同浓度的Zr-MOFs作用下,细胞存活率均在90%以上,即使是200μg/m L的较高浓度下也没有较为明显的细胞毒性,表明该探针在细胞内具有良好的生物相容性。另外,Hg2+在1n M到10μM范围内均展现出较小的细胞毒性。在上述条件下,细胞成像结果显示,当不存在Hg2+时,细胞内未发现明显的蓝色荧光信号,但随着Hg2+浓度的增加,蓝色荧光信号强度明显递增。提示T20/A10-Zr-MOFs荧光探针可用于细胞内Hg2+的可视化检测。研究结论:本研究构建了一种新型细胞内Hg2+成像的纳米荧光探针。利用DNA磷酸骨架与MOF不饱和位点的相互作用,将T-A杂交双链固载到MOF表面。同时,利用荧光基团AMCA与猝灭基团Dabcyl之间的荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）过程,实现荧光信号的关闭状态。通过细胞内PO43-与DNA磷酸骨架的竞争结合,T-A杂交双链从Zr-MOFs表面解吸并游离到细胞内。在Hg2+存在的情况下,利用T-Hg2+-T错配结构的作用力大于A-T之间作用力的特点,A-T杂交双链分开,两个基团之间的距离增大,FRET过程消失,以此实现荧光信号由关到开,从而达到细胞内Hg2+的可视化检测目的。本研究为细胞内痕量Hg2+检测技术创新和汞污染的监测防控提供了新的策略和实验依据。