论文部分内容阅读
目的观察MicroRNA Let-7f对胰腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭与迁移等生物学行为的影响,初步探讨Let-7f在胰腺癌发生发展中的作用及其可能机制,为临床胰腺癌的早期诊断及抗癌药物的开发提供新的靶点和实验依据。方法1、采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)的方法检测Let-7 mi RNAs在正常胰腺细胞株HPDE6C7及胰腺癌细胞株PANC-1和Bx-PC3中的表达差异。2、分别运用功能获得性实验和功能缺失性实验将Let-7f模拟物和抑制物转染至胰腺癌PANC-1和Bx-PC3细胞中,RT-qPCR法检测转染后Let-7f在细胞中的表达变化情况。采用CCK-8法检测改变细胞内Let-7f表达对细胞增殖的作用;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测Let-7f表达变化对细胞凋亡的影响;Transwell小室法检测调节Let-7f表达对细胞侵袭和迁移能力的作用;RT-qPCR法检测侵袭相关基因基质金属蛋白酶11(matrix metalloproteinases 11,MMP-11)、核糖核苷酸还原酶小亚基M2(ribonucleotide reductase M2,RRM2)及Zeste基因增强子同源物2(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)的表达情况;Western Blot法检测MMP-11在蛋白水平的表达情况。3、构建稳定过表达Let-7f的PANC-1细胞(LV-Let-7f-PANC-1),分别将LV-Let-7f-PANC-1和对照LV-NC-PANC-1细胞注射至BALB/c裸鼠皮下,观察两组裸鼠注射部位肿瘤的形成情况,比较两组肿瘤质量及肿瘤组织内MMP-11的表达情况,分析Let-7f对胰腺癌细胞体内成瘤能力的作用。4、收集60例胰腺癌患者血浆,同时收集60例健康体检者血浆为对照,采用RT-qPCR法比较胰腺癌患者和健康对照者血浆中Let-7f的表达差异,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)检测两组研究对象血浆中MMP-11的表达水平。统计分析胰腺癌患者血浆中Let-7f表达水平与临床病理因素之间的关系,Let-7f与MMP-11之间的相关性。采用Kaplan-Meier法分析Let-7f表达水平与患者预后之间的关系。结果1、RT-qPCR结果显示Let-7mi RNAs中仅Let-7f在PANC-1和Bx-PC3中表达量均低于HPDE6C7细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。2、PANC-1和Bx-PC3细胞在转染Let-7f模拟物后,细胞中Let-7f表达量显著升高(P<0.05);相反,转染Let-7f抑制物后,细胞内Let-7f表达明显下调(P<0.05)。CCK-8法结果显示,Let-7f模拟物转染组和Let-7f抑制物转染组的细胞增殖活力与对照组相比,差异均无统计学意义(均P>0.05)。流式细胞术结果表明,虽然Let-7f模拟物转染组的凋亡细胞所占的比例比对照组略多,而转染了Let-7f抑制物组中凋亡细胞数则略低于对照组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。Transwell小室法结果显示,Let-7f模拟物转染组穿过Matrigel基质胶的细胞数明显少于对照组(P<0.05);而Let-7f抑制物转染组穿过Matrigel基质胶细胞数与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。迁移实验结果相似,上调胰腺癌细胞中Let-7f的表达可抑制细胞迁移,而下调Let-7f的表达,细胞迁移能力无显著变化。经RT-qPCR和Western Blot检测,Let-7f模拟物转染组中MMP-11的表达量较对照组要明显减少(P<0.05);而Let-7f抑制物转染组中MMP-11的表达量较对照组要显著升高(P<0.05)。RRM2和EZH2变化不显著,差异无统计学意义(P>0.05)。3、体内荷瘤实验结果显示,LV-Let-7f-PANC-1组肿瘤的质量比LV-NC-PANC-1组显著减少(P<0.05),且肿瘤组织中MMP-11的表达水平较LV-NC-PANC-1组明显降低(P<0.05)。4、Let-7f在胰腺癌患者血浆中的表达水平显著低于健康对照组(P<0.05),相反,MMP-11在胰腺癌患者血浆中的表达水平要高于健康对照组(P<0.05)。统计分析结果表明,血浆Let-7f表达水平与肿瘤的TNM分期(P=0.002)、淋巴结转移(P=0.013)、远处转移(P=0.007)显著相关;而与胰腺癌患者的性别(P=0.755)、年龄(P=0.066)、肿瘤发生部位(P=0.435)、肿瘤大小(P=0.348)及分化程度(P=0.267)无明显相关关系。Pearson相关分析显示,血浆中Let-7f与MMP-11表达呈负相关(r=-0.678,P<0.001)。Kaplan-Meier法结果表明,Let-7f低表达组患者的中位生存时间比Let-7f高表达组短,预后较差(c2=18.618,P=0.000)。结论1、Let-7f可能通过调控MMP-11抑制胰腺癌细胞侵袭和迁移,参与胰腺癌的发生发展。2、Let-7f在胰腺癌患者血浆中低表达,可作为胰腺癌临床诊断及判断预后的指标之一。