葡萄糖二酸是一种重要的高附加值化学品,其在食品、医药保健、纺织服装等领域都有广泛应用。本实验室前期研究中采取了一系列的代谢工程策略以提高酿酒酵母葡萄糖二酸的产量,构建的酿酒酵母菌株K4-DZWF1在5 L发酵罐中葡萄糖二酸产量达到10.85g·L-1,但肌醇加氧酶（inositol oxygenase,MIOX4）的酶活力仍旧很低,并且稳定性很差,无法满足应用要求,因此,采用定向进化的方法筛选出酶活力较高MIOX4具有重要意义。定向进化中突变体文库的筛选是一个关键问题,酿酒酵母中葡萄糖二酸传感器的构建还未有报道,在真核生物中开发一个识别化学物质生物传感器的通用方法是非常有意义的。本文主要通过以下三个方面进行研究:（1）采用定向进化的方式代谢改造肌醇加氧酶MIOX4以提高其催化活性。以酿酒酵母作为底盘微生物,通过半理性进化-易错PCR的方法对来自拟南芥基因组的肌醇加氧酶MIOX4的关键氨基酸序列进行随机突变。以葡萄糖二酸的产量为筛选指标,利用大肠杆菌葡萄糖二酸传感器对MIOX4的突变体进行高通量筛选。实验结果显示,从突变体文库中筛到4株有潜力的MIOX4突变体（S133R、K88R、E72V、T40P）,使得葡萄糖二酸产量相较于野生型菌株分别提高了53%、30%、21%、17%。通过对突变体MIOX4（S133R）进行结构分析,发现突变位点R133增大了该位点与底物肌醇之间的空间距离,从而减少了空间位阻,提高了对底物肌醇的催化能力。（2）通过RNA-Seq技术分析了酿酒酵母细胞中对葡萄糖二酸有响应的启动子元件,构建葡萄糖二酸传感器。通过转录组测序,确定了36个基因的表达被葡萄糖二酸明显上调,以酿酒酵母BY4741opi1Δ为宿主菌株,通过构建GFP报告质粒,发现启动子PYCR012W和PYGL009C对葡萄糖二酸的响应最显著,通过检测它们对不同浓度葡萄糖二酸的响应情况,发现PYCR012W对葡萄糖二酸有剂量依赖性,且线性关系最好,因此,PYCR012W可以作为构建葡萄糖二酸生物传感器的响应元件。（3）通过截短响应葡萄糖二酸的启动子元件确定对葡萄糖二酸响应的转录因子。通过对PYCR012W的5’位点上游区域依次截短100 bp,发现在截短长度超过300 bp时,荧光信号骤降,并且GFP报告基因响应葡萄糖二酸的诱导也被抑制,说明PYCR012W中-564至-464 bp区域可能包含响应葡萄糖二酸转录因子的DNA结合序列,通过预测该区域的转录因子结合位点,在敲除转录因子编码基因的突变体中检测PYCR012W-GFP对葡萄糖二酸的响应,发现Ash1p和Cbf1p两个转录因子与葡萄糖二酸的响应有关。综上所述,本研究通过定向进化筛到一株MIOX4（S133R）突变体,使得葡萄糖二酸的产量比野生型提高了53%;利用酿酒酵母自身的元件构建了葡萄糖二酸生物传感器,并且发现Ash1p和Cbf1p两个蛋白跟葡萄糖二酸的响应有关,为后续构建更灵敏的葡萄糖二酸传感器奠定基础。