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成纤维细胞是肾间质纤维化进程中合成和分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的主要细胞,各种原因导致的肾脏损伤促使炎性因子在肾脏聚集,激活成纤维细胞,分泌大量的ECM,造成局部细胞生存的微环境改变。当ECM生成达到一定程度,即使引起原始肾损伤的病因已经去除,肾脏固有细胞也会在此微环境的刺激下不断发生表型转化,推动肾间质纤维化进程向不可逆方向发展。微小RNA(miRNAs)是一种非编码的短链RNA,可通过调控靶标mRNA的表达广泛地参与到多种生命过程中。在肾脏,miRNAs可以调控肾脏的发育,并参与肾脏正常功能的发挥。目前,miRNAs也被证明参与到包括肾间质纤维化在内的众多肾脏疾病的调控中,并可以作为疾病的诊断依据及治疗靶点。绞股蓝皂苷(Gypenosides,GPs)是绞股蓝的主要成分,在课题组前期开展的基于体外模型的300余种中药化合物高内涵筛选中显示出良好的抗肾纤维化药效,但其作用的最佳浓度及作用机制尚不明确,且目前有关GPs抗肾间质纤维化作用的研究报道较少。另有研究表明GPs可通过调控miRNAs表达发挥抗肿瘤、抗抑郁、改善心血管疾病的作用。基于此,本研究以TGF-β1诱导NRK-49F细胞构建体外模型探讨GPs抗肾间质纤维化作用的最佳浓度,并在此基础上进一步研究其抗肾间质纤维化作用是否与调控miRNAs的表达有关。方法1.体外培养大鼠肾间质成纤维细胞NRK-49F,不同浓度GPs干预细胞48 h后,CCK-8法检测其对细胞增殖的影响,确定对细胞活性无显著影响的最高浓度,设定用于后续研究的药物作用浓度;2.以10 ng/ml TGF-β1刺激NRK-49F细胞构建肾间质纤维化体外模型,加入不同浓度的GPs进行干预,免疫荧光法检测α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ 型胶原(type Ⅰ collagen,COLⅠ)、Ⅲ 型胶原(type Ⅲ collagen,COLⅢ)表达情况,初步评价不同浓度GPs对成纤维细胞活化及分泌ECM的干预作用;3.同上方法构建肾间质纤维化细胞模型,加入不同浓度GPs干预,RT-PCR、WB法检测α-SMA mRNA及蛋白表达情况,以评价GPs对成纤维细胞活化的影响;4.同上方法构建肾间质纤维化细胞模型,加入不同浓度GPs干预,RT-PCR、WB法检测COLⅠ、COLⅢ的mRNA及蛋白表达情况,以评价GPs对激活的成纤维细胞分泌ECM的影响;5.同上方法构建肾间质纤维化细胞模型,加入75 μM GPs干预48 h,small RNA测序检测各组中miRNAs表达情况,对比正常组与模型组中差异表达的miRNAs,运用计算机分析方法(targetscan、miranda、rnahybrid)构建miRNAs靶基因预测模型,对差异表达的miRNAs进行下游靶基因预测,预测结果进行GO、KEGG分类分析及富集分析;6.将“正常组vs模型组”和“模型组vs GPs组”中存在显著差异表达的基因取交集,寻找GPs可能作用的miRNAs靶点,对靶标miRNAs进行下游靶基因分析,观察其潜在的下游作用靶点,并探究靶点显著相关的生物学通路过程。结果1.GPs干预NRK-49F细胞48h的IC20为52.722 μM,据此设定后续实验中GPs干预浓度分别为75μM、50μM、25μM;2.免疫荧光检测结果表明TGF-β1刺激可引起NRK-49F细胞中α-SMA、COL Ⅰ、COLⅢ蛋白表达量增加,加入不同浓度GPs干预后,α-SMA、COLⅠ、COLⅢ蛋白表达量较模型组显著下调,以75 μM组作用效果最佳;3.RT-PCR、WB检测结果表明不同浓度GPs干预后可抑制α-SMA mRNA及蛋白的表达,且抑制作用呈浓度依赖性,以75 μM效果最佳,其中,25 μM GPs对α-SMA mRNA表达的抑制作用与模型组相比无显著差异;4.RT-PCR、WB检测结果表明不同浓度GPs干预后可抑制COLⅠ、COLⅢmRNA及蛋白的表达,且抑制作用呈浓度依赖性,以高浓度(75 μM)效果最佳。其中,25 μM、50μM GPs对COLⅠ蛋白表达抑制作用与模型组相比无显著差异;5.Small RNA测序结果表明,miRNAs在NRK-49F细胞中含量丰富,对多个生物学过程和信号通路产生调控作用;TGF-β1诱导成纤维细胞激活后,151个miRNAs的表达量发生显著变化,其中77个表达上调,74个表达下调;GPs干预后,可显著改善18个miRNAs的表达,其中10个表达上调,8个表达下调;靶基因分类分析及富集分析结果表明,成纤维细胞活化后,细胞质、核、细胞成分、胞质溶胶、细胞连接、细胞骨架等多个部位细胞组成成分发生改变,磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ的转录正调控、蛋白质磷酸化、离子迁移、转录的正调控等多种分子功能发生改变;参与金属离子结合、分子功能、蛋白结合、ATP结合、核苷酸结合等生物学过程的蛋白发生改变,差异表达显著的151个miRNAs下游调节靶点与代谢通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、磷脂酶D信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路、激动蛋白细胞骨架调节、轴突导向等信号转导过程具有显著相关性;6.交集分析结果表明,TGF-β1诱导可下调miR-3588、miR-378a-5p表达,上调miR-135b-5p、miR-3068-5p表达,加入GPs干预后可逆转这一作用,这4个miRNAs可能是GPs调节肾间质纤维化进程的潜在关键上游调控因子;对其下游靶基因预测分析,结果表明这4个miRNAs调控的靶基因在MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、磷脂酶D信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路、mTOR信号通路、钙信号通路、Wnt信号通路中存在显著富集,其中PI3K/Akt信号通路富集的靶基因数目最多,共 19 个,其中 16 个为 miR-378a-5p 的靶基因,包括 Tp53、Tgfa、Ifnar1、Lpar1、Ccne1、Ngfr、G6pc、Lpar4、Tsc1、Pik3ca、Co16a2、Rela、Brca1、Phlpp2、Igf2、Rptor,且主要集中在PI3K及其上游靶点中。据此分析miR-378a-5p/PI3K-Akt可能是GPs发挥抗肾间质纤维化的重要信号通路之一。结论GPs可显著抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞活化,减少ECM的异常沉积而起到抗肾间质纤维化作用,其抑制作用呈浓度依赖性,75 μM的作用效果最为显著;其作用机制可能与上调 miR-3588、miR-378a-5p 表达,下调 miR-135b-5p、miR-3068-5p 表达进而引起下游通路中相关靶基因表达改变有关,其中,miR-378a-5p/PI3K-Akt可能是其发挥抗肾间质纤维化的重要作用通路之一。