论文部分内容阅读
疼痛是包括实际或潜在组织损伤引起的生理感觉及与之伴随的沮丧、烦躁甚至绝望等有关情绪反应的综合情感体验。疼痛是人类最常见的疾病症状之一，当前疼痛处理在很大程度上依赖于1）:非麻醉性镇痛药（对乙酰氨基酚和阿司匹林）;2）:麻醉性镇痛药（阿片类药物）3）:非甾体抗炎药(NSAIDs)。虽然目前镇痛药对缓解症状具有很大的益处，不过据估计，仅有1/4的疼痛能够通过治疗得到缓解。目前批准的药物也往往是耐受性差、副作用大，长期安全性令人担忧。显然，新型的更具潜力的镇痛药物成为当前亟需开发的产品。 作为一味重要的传统中药，人们普遍使用蚯蚓全体入药的方式来治疗各种疾病，其引起了越来越多科学家的关注，近来有越来越多的研究报道蚯蚓体腔液有解热镇痛的功效，但具体作用分子及其发挥功效的机制尚未得以阐明。 在本研究中，通过凝胶过滤和反相高压液相层析从赤子爱胜蚓的体腔液中得到两个具有镇痛及抗炎功能的多肽，命名为VQ-5和AQ-5。通过Q-TOF2质谱测序法测定它们的氨基酸序列分别为VSSVQ和AMADQ。MALDI-TOF-MS分析它们的分子量分别为519.299 Da和535.300 Da。 对VQ-5和AQ-5可能具有的镇痛及抗炎活性进行了研究，发现VQ-5具有轻微的镇痛活性，而AQ-5具有显著的镇痛及抗炎功能。用四个重要的镇痛活性检测方法对VQ-5及AQ-5的镇痛作用进行了研究，这四个试验方法包括小鼠光辐射热甩尾试验、热板试验、小鼠扭体试验以及福尔马林试验。小鼠光辐射热甩尾试验和热板试验用于评价VQ-5及AQ-5在中枢性疼痛中的镇痛作用。实验结果表明1）:AQ-5能显著增长小鼠发生摆尾动作的反应时间和舔足或跳出热板的反应时间，并呈剂量和时间依赖关系。而VQ-5在这两个镇痛试验中的镇痛作用不明显;2）:AQ-5能显著地抑制福尔马林引起的小鼠在第二时相的舔足反应，而对第一时相的疼痛反应影响很小，表明AQ-5可以减轻伴随着炎症反应的外周性疼痛。3）:AQ-5能显著降低腹腔注射乙酸所引起的小鼠腹部扭体反应。这一结果同样表明AQ-5的镇痛作用与其在外周的抗炎症活性有关，因为小鼠腹部扭体试验的致痛作用是由于小鼠腹部注射乙酸后，花生四烯酸在环加氧酶的作用下产生前列腺素所引起的。 AQ-5在角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀模型中的镇痛作用同样印证了以上的假设。角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀是一个标准的筛选抗炎药物的经典模型。该模型的致炎作用与前列腺素的大量合成及诱导性环氧合酶在足掌部位的生成有关。同时，角叉菜胶诱导的炎症反应与中性粒细胞的浸润和其它来源子中性粒细胞的炎症介质的释放关联在一起。AQ-5显著的抑制角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀。这一结果与AQ-5在乙酸诱导的小鼠腹部扭体模型和福尔马林引起的舔足模型中的镇痛作用相吻合。 如上所述，乙酸引起的小鼠腹部扭体试验、福尔马林诱导的舔足试验以及角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀试验都与环加氧酶(COXs)以及前列腺素(PG)密切相关。COX-2可以增加前列腺素类炎症反应介质的生成。TNF-α是免疫反应的主要炎症介质。在角叉菜胶诱导的足趾肿胀模型中，AQ-5可以显著抑制小鼠足趾组织COX-2及TNF-α的产生。这一结果说明AQ-5通过抑制COX-2及TNF-α的生成从而在角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀模型中发挥抗炎症作用。为了进一步验证AQ-5的抗炎症作用，对角叉菜胶致炎的小鼠足趾进行了组织病理学研究。组织病理学结果表明AQ-5能减轻角叉菜胶引起的炎症反应症状。 Western Blot检测发现AQ-5能够抑制LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7产生的ERK1/2及JNK激酶的磷酸化，而VQ-5只对ERK1/2的磷酸化有抑制作用。此外，AQ-5能够抑制IKKα/β的磷酸化和IκBα的降解。以上结果表明MAPKs信号通路中的ERK1/2和JNK以及NF-κB信号通路参与了AQ-5的镇痛及抗炎症功能。 总之，本文从赤子爱胜蚓体腔液中得到两个具有镇痛及抗炎症功能的多肽VQ-5及AQ-5，它们通过作用于MAPKs信号途径来发挥其炎症抑制作用，深入解析了蚯蚓作为传统镇痛中药的物质基础，为赤子爱胜蚓体腔液中活性多肽的结构功能研究提供和补充了重要的实验数据和结果:本研提供了两个新的镇痛及抗炎剂先导结构分子，对开发新型的、具有临床应用潜力的镇痛及炎症抑制剂具有积极的参考价值。