【摘 要】
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组织因子（Tissue factor,TF）是由263个氨基酸组成的跨膜单链糖蛋白,分子量为47 KDa,是外源性凝血的启动子。当血管破裂时,TF激活凝血级联反应,导致凝血酶的爆发式生成,产生大量的血小板,使血液凝固。临床医学中,将血浆中添加TF后凝固所需要的时间定义为凝血酶原时间（Prothrombin time,PT）。PT的延长或缩短与多种疾病相关,是血液临床检验的常规项目,用于PT检测的就
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组织因子（Tissue factor,TF）是由263个氨基酸组成的跨膜单链糖蛋白,分子量为47 KDa,是外源性凝血的启动子。当血管破裂时,TF激活凝血级联反应,导致凝血酶的爆发式生成,产生大量的血小板,使血液凝固。临床医学中,将血浆中添加TF后凝固所需要的时间定义为凝血酶原时间（Prothrombin time,PT）。PT的延长或缩短与多种疾病相关,是血液临床检验的常规项目,用于PT检测的就是PT试剂。长期以来,PT测定试剂的制备都是从兔脑、牛脑、人脑、胎盘等组织中提取TF配制而成。因为这些组织提取物所含的TF的浓度不同对凝血的反应敏感度不同,所以用其生产的PT试剂普遍存在产品质量不稳定,敏感性差,检测结果不稳定的问题,不同的临床检验实验室之间得到的检测结果难以比较。目前国外有少数公司利用基因工程技术合成了人重组组织因子（recombinant human tissue factor,rh TF）,这种rh TF分子结构均一,质量稳定,使用rh TF制成的PT测定试剂提高了PT测定的敏感性、精密度和准确度,在临床医学检验上被认为是新一代的标准化PT试剂,相关技术在国内还需要进一步发展和完善。本文根据TF三个结构域在凝血过程中的不同作用,利用基因工程技术设计不同的TF突变体,建立TF在大肠杆菌中简单、高效的功能性表达和纯化方法,并通过模拟生物膜与纯化TF的体外自组装制成具有均一性和稳定性的PT试剂。课题的主要内容如下:1)本实验依据TF的结构特点,构建了三个突变体:rh TF219（胞外结构域）、rh TF242（胞外与跨膜结构域）以及rh TF263（全长结构域）,并在每个突变体基因末端融合表达6×His标签,分别在大肠杆菌中进行表达。结果发现,rh TF219在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,经8 M尿素溶解纯化后,可纯化得到纯度为95%以上的蛋白,产量为2.9mg/L;rh TF242和rh TF263在大肠杆菌中主要以膜整合蛋白形式表达,经Triton X-100进行增溶并纯化,蛋白的纯度在95%和50%左右,产量分别为5.0 mg/L和0.7 mg/L。TF活性检测实验表明,rh TF219与rh TF263活性偏低,rh TF242活性最高,本部分研究为进一步配置和优化PT试剂奠定重要的基础。2)TF必须与磷脂结合后才具有全部的促凝血活性,所以凝血诊断应用时需要首先对TF进行磷脂化。本部分研究基于rh TF242突变体与磷脂（磷酯酰丝氨酸,PS;磷脂酰胆碱,PC）以及表面活性剂自组装,构建新型PT试剂。经过对PT试剂构建系统的优化,确定PT试剂的最优组成:TF终浓度为30 n M、磷脂（PC:PS质量）的比例为7:3、理想表面活性剂为脱氧胆酸及其终浓度为0.05 m M,并且研究发现加入100mg/m L的海藻糖利于PT试剂的冻干或低温储存。接下来对优化的PT试剂配方进行了一年的稳定性测试。结果表明其可以达到临床体外诊断要求且具有配制简便、价格低廉、易于大规模生产等特点。3)在上述利用磷脂囊泡配置PT试剂的基础上,我们还进一步尝试体外重组的新型脂质体,即用磷脂纳米圆盘代替磷脂囊泡与TF自组装制成新型的PT试剂。新型磷脂纳米圆盘合成时,首先对苯乙烯-马来酸酐（SMA）进行官能团改性,分别制备出带负电荷和带正电荷的聚合物。然后,将改性SMA聚合物与磷脂按照不同质量比例组装,制成大小可控（10nm～100nm）的磷脂纳米圆盘。分别采用动态光散射和透射电子显微镜对其大小和形貌进行表征,并利用静态光散射对磷脂纳米圆盘的稳定性进行表征。磷脂与SMA聚合物按照质量比1:1、1:2以及1:3合成的磷脂纳米圆盘粒径大小分别为100 nm、40 nm以及10 nm左右。随着聚合物比例增加,磷脂纳米圆盘对二价金属离子(Ca2+和Mg2+)以及温度的稳定性越强。将磷脂纳米圆盘与TF自组装制成新型PT试剂,用TF活性检测试剂盒和凝血仪测其活性,PT可以达到12.7 s。初步证明了磷脂纳米圆盘与TF自组装具有临床检测的应用价值。
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