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研究背景与目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在全球分别排第三和第四位。在中国,其发病率逐年上升;进展期或中晚期CRC的5年生存率低。因此,探究CRC的发病机理和寻找新的防治靶标具有重要意义。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)为肿瘤的进展提供适宜的环境,其主要包括两类成分,一类是非细胞成分,包括多种细胞因子、多种分泌蛋白(例如S100A6)等;另一类为细胞成分,例如巨噬细胞(macrophages,Mφ)。TME中的这些成分相互作用,从而促进肿瘤的进展。钙周期素S100A6是S100家族成员之一,参与调控细胞增殖、凋亡、细胞骨架重塑和应激反应等;在CRC组织和细胞系中,S100A6呈高表达,并促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭,与病人的不良预后密切相关。作为分泌蛋白的S100A6可通过旁/自分泌方式与靶细胞表面的糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)和Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)结合而发挥作用。TME中数量最多的免疫细胞是Mφ,占肿瘤间质细胞的30%-50%,可通过多种机制促进肿瘤的发生发展,如免疫逃逸、细胞活化和增殖、肿瘤的迁移和侵袭等。骨髓来源的Mφ在TME各种因素(细胞因子、分泌蛋白等)的影响下,分化成为M1型即炎症相关巨噬细胞和M2型即肿瘤相关巨噬细胞。在CRC病人肿瘤组织中,M2型的数量较多,具有促进CRC的生长和侵袭的作用,并与病人的治疗失败和预后不良密切相关。然而,TME中细胞因子是如何影响Mφ,受影响后的Mφ对癌细胞的作用和分子机制尚未完全阐明。已知,S100A6存在于CRC微环境中,并可通过与靶细胞上的受体RAGE或TLRs结合而发挥作用;TME中的Mφ既有RAGE表达,也有相应的信号转导机制。因此,我们推测CRC微环境中的S100A6除已知的直接作用于CRC细胞外,还能够通过与Mφ的RAGE或TLRs结合而影响Mφ的功能,再由后者(即经S100A6驯化的Mφ)促进CRC的进展。本研究以人单核细胞系THP-1及人结直肠癌细胞LoVo、HCT116作为研究对象,探讨微环境中S100A6对巨噬细胞功能的影响及被S100A6驯化的巨噬细胞对人结直肠癌细胞增殖的作用及相关机制。希望为阐明CRC微环境中S00A6、巨噬细胞、CRC细胞之间复杂的相互作用及机制积累实验依据,也为CRC的临床治疗提供新思路。方法1重组人融合蛋白GST-human S100A6(rhS100A6)和GST的制备与鉴定。2巨噬细胞和S100A6驯化的巨噬细胞的诱导制备2.1诱导THP-1细胞为Mφ:100 ng/mL佛波酯(phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)处理THP-1细胞24 h后,细胞停止增殖,大部分细胞从悬浮状态转变为贴壁生长,从圆形变成扁平椭圆形、多边形,部分细胞伸出伪足,此即后续实验中的Mφ。2.2 rhS100A6处理Mφ:用rhS100A6(100μg/mL)或GST(100μg/mL)处理Mφ24h,处理后的细胞分别为S100A6驯化的Mφ(A6-Mφ)或对照组的Mφ(GST-Mφ)。3 S100A6对Mφ的作用及机制3.1 S100A6对Mφ分化的影响及机制3.1.1采用qPCR检测A6-Mφ中M1型标志基因(TNF-a、iNOS)、M2型标志基因(CD206、CD163)的mRNA水平变化;3.1.2通过Western blot检测A6-Mφ中M2型相关蛋白CD206、PD-1、MMP7、MMP9和VEGFA的蛋白质水平变化;3.1.3分别采用qPCR和Western blot检测A6-Mφ的RAGE和TLR4的mRNA和蛋白质水平变化;3.1.4 RAGE抑制剂FBS-ZM1和TLR4抑制剂TAM-242分别预处理Mφ30分钟,再用rhS100A6处理24h后,采用qPCR检测细胞中M1型相关基因(TNF-a、iNOS)和M2型相关基因(CD206、CD163)的mRNA水平。3.2 S100A6对Mφ增殖的作用及机制3.2.1运用CCK8、MTT检测rhS100A6对Mφ的存活能力的影响以及该影响是否具有浓度依赖性和时间依赖性;3.2.2分别采用qPCR和Western blot检测A6-Mφ的RAGE和TLR4的mRNA和蛋白质水平;3.2.3 RAGE抑制剂FBS-ZM1和TLR4抑制剂TAM-242分别预处理Mφ30分钟,再用rhS100A6处理24h后,应用CCK8检测细胞的存活能力。3.3 S100A6对Mφ中S100A6表达的影响采用qPCR和Western blot分别检测A6-Mφ中S100A6的mRNA和蛋白质水平。4 S100A6驯化的Mφ对人结直肠癌细胞增殖的作用及机制。4.1 A6-Mφ分别与CRC细胞LoVo和HCT116共培养24h后:4.1.1采用台盼兰染色计数法、MTT、CCK、结晶紫染色和FCM分别检测CRC细胞的活力、增殖和凋亡发生率;4.1.2应用Western blot检测HCT116中增殖相关蛋白质即c-Myc、增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)和凋亡相关蛋白即活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8(cleaved-caspase8)的表达变化。4.2 S100A6驯化的Mφ促人结直肠癌细胞增殖作用的机制4.2.1分别采用qPCR和Western blot检测A6-Mφ中IL-6的mRNA和蛋白质的水平;4.2.2 IL-6R封闭肽预处理HCT116 30min,再与A6-Mφ共培养。24h后,分别采用MTT和FCM检测HCT116的活力和凋亡发生率;4.2.3 A6-Mφ与人结直肠癌细胞HCT116共培养24h后,通过Western blot检测HCT116中t-JAK2、p-JAK2、t-STAT3、p-STAT3水平的变化结果1成功制备本研究所需的重组蛋白rhS100A6和GST。2 S100A6对Mφ的作用及机制2.1 S100A6促Mφ向M2型分化,机制涉及RAGE信号通路。2.1.1 rhS100A6下调Mφ中M1型标志基因iNOS、TNF-a的mRNA水平(P<0.05),上调其M2型标志基因CD206、CD163的mRNA水平(P<0.05)。提示S100A6可促进Mφ向M2型分化。2.1.2 rhS100A6促进Mφ向M2型分化的作用被RAGE抑制剂FBS-ZM1逆转(P<0.05),而不能被TLR4抑制剂TAM-242逆转(P>0.05)。提示S100A6是通过与RAGE的结合而实现其促Mφ向M2型分化的作用。2.2 S100A6促进Mφ增殖,其机制涉及RAGE和TLR4两个信号通路。rhS00A6提高Mφ的存活能力(P<0.05),并且该作用可被RAGE抑制剂和TLR4抑制剂逆转(P<0.05)。2.3外源性S100A6可上调Mφ中S100A6的表达:rhS100A6组的Mφ中S100A6的mRNA和蛋白质水平分别是GST组的1.6倍和2.1倍(P<0.05)。提示S100A6在巨噬细胞中的表达与外环境中S100A6的水平之间存在正反馈调节效应。3 S100A6驯化的Mφ促进人结直肠癌细胞HCT116的增殖,其机制涉及S100A6上调Mφ中IL-6的表达,继而IL-6与HCT116上的IL-6R结合,激活HCT116细胞的JAK2/STAT3信号通路。3.1与A6-Mφ共培养的HCT116细胞:增殖活力增加(P<0.05),凋亡发生率降低(P<0.05),c-Myc、PCNA的表达增加(P<0.05),cleaved-caspase3、cleaved-caspase8的表达减少(P<0.05)。提示S100A6可通过驯化Mφ而提高人结直肠癌细胞的活力和抑制其凋亡。3.2 A6-Mφ中IL-6的mRNA和蛋白质水平增加(P<0.05);与A6-Mφ的共培养致HCT116细胞中p-JAK2和p-STAT3的蛋白质水平增加(P<0.05),但t-JAK2和t-STAT3的蛋白质水平无明显变化(P>0.05);A6-Mφ促HCT116细胞增殖和抑制凋亡的作用被IL-6R阻断剂部分逆转(P<0.05)。提示S100A6驯化的Mφ(A6-Mφ)促进CRC细胞增殖的机制涉及IL-6/JAK2/STAT3信号通路的激活。结论1 S100A6对巨噬细胞具有驯化作用,包括促进Mφ向M2型分化和提高Mφ的存活能力;其促分化机制涉及RAGE信号通路的激活,而其促增殖机制涉及RAGE和TLR4两个信号通路的激活。2微环境中的S100A6与Mφ中S100A6的表达存在正反馈效应。3 S100A6驯化的Mφ具有促进CRC细胞增殖的作用,其机制涉及CRC细胞IL-6/JAK2/STAT3信号通路的激活。