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研究目的达托霉素属于环脂肽类抗菌药物,是一种具有很强杀菌作用的细胞膜活性化合物,主要适用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的复杂感染。目前金黄色葡萄球菌对达托霉素的耐药机制未明。研究金黄色葡萄球菌对达托霉素的耐药机制既有助于为新药物的开发提供思路,也有助于研究出针对耐药靶点的方案进一步减缓细菌耐药的发展。本研究通过体外诱导金黄色葡萄球菌对达托霉素产生耐药性,对耐药菌株的表型特征及耐药机制进行研究。研究方法1.收集全国不同地区分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,根据2020年美国临床实验室标椎化协会（CLSI）制定的标椎,用微量肉汤稀释法对金黄色葡萄球菌进行达托霉素MIC的测定。2.采用适应性实验室进化的方法,用亚抑菌浓度的达托霉素连续传代培养使金黄色葡萄球菌USA300、Newman和SA75对达托霉素产生耐药性。3.通过药物敏感实验测定达托霉素诱导耐药菌株对其他一些抗菌药物敏感性的变化。4.以野生菌株为对照,测定达托霉素诱导耐药菌株生长及毒力表型的变化:通过测定生长曲线和将等量耐药菌株与其对应的野生菌株置于相同的环境中竞争生长观察达托霉素耐药后金黄色葡萄球菌生长速度的变化;通过测定野生菌株和达托霉素耐药菌株对兔红细胞裂解能力以及对大蜡螟和小鼠皮肤的致病能力来检测达托霉素耐药后金黄色葡萄球菌体内、外毒力的变化。5.以野生菌株为对照,测定达托霉素诱导耐药菌株耐药相关表型的变化:利用透射电镜对金黄色葡萄球菌细胞壁厚度进行测量;利用细菌结合细胞色素C的能力观察细菌表面的电荷情况;利用Triton X-100诱导细菌自溶检测细菌的自溶能力;利用结晶紫染色观察细菌的生物膜形成能力;通过膜探针Di OC2（3）测定细菌初始膜电位。6.将Newman和Newman-DNS进行转录组测序,再用RT-q PCR验证达托霉素耐药相关基因表达量的变化。7.通过全基因组测序的SNP结果分析,找出可能与耐药相关的基因位点突变。8.确定达托霉素诱导耐药菌株与耐药相关的位点突变,对野生菌株进行基因编辑,通过同源重组的方法在野生菌株中构建位点突变的菌株,并回复该突变。研究结果1.407株MRSA均对达托霉素敏感,达托霉素对407株MRSA的MIC值范围为0.06μg/m L-1μg/m L,MIC50为0.25μg/m L,MIC90为0.5μg/m L,MIC值的几何平均数为0.25μg/m L。其中达托霉素MIC值为0.06μg/m L的MRSA占3.19%,MIC值为0.125μg/m L的占24.57%,MIC值为0.25μg/m L的占50.37%、MIC值为0.5μg/m L的占15.97%、MIC值为1μg/m L的占5.90%。2.经达托霉素诱导耐药后,达托霉素对金黄色葡萄球菌USA300的MIC值从0.25μg/m L上升至16μg/m L,对Newman的MIC值从0.25μg/m L上升至32μg/m L,对SA75的MIC值从0.25μg/m L上升至32μg/m L。在无抗的环境下连续传代培养15次仍对达托霉素耐药,具有一定的耐药稳定性。3.以野生菌株为对照,达托霉素诱导耐药菌株对糖肽类药物和庆大霉素的敏感性降低,对β-内酰胺类药物的敏感性增加。4.相对于野生菌株,达托霉素诱导耐药菌株生长速度减慢、生长竞争能力较弱,对兔红细胞的裂解能力减弱、感染大蜡螟的致死率降低、造成小鼠皮肤脓肿严重程度减弱。金黄色葡萄球菌对达托霉素耐药后生长速度减慢、在体内、外的毒力减弱。5.相对于野生菌株,达托霉素诱导耐药菌株有细胞壁增厚、细胞表面正电荷增加、自溶活性增强、生物膜形成能力增强、初始细胞膜电位降低的耐药相关表型改变。6.以野生菌株为对照,三株达托霉素诱导耐药菌株与膜磷脂代谢相关的mpr F、cls2基因和与自溶相关的lyt M基因均上调。Newman和其对应的诱导耐药菌株的转录组结果显示与sae RS双组分调节系统相关的基因表达量变化显著,PCR测序发现sae R基因部分片段缺失,表明Newman对应的诱导耐药菌株毒力的显著降低与可能与sae R基因的突变有关。7.在USA300诱导耐药菌株发现了与达托霉素耐药相关的mpr F S295L位点突变;在Newman诱导耐药菌株发现了与达托霉素耐药相关的mpr F L341F和cls2 F60S位点突变;在SA75诱导耐药菌株发现了与达托霉素耐药相关的mpr F L826F和cls2 F60L位点突变。8.已有研究证实mpr F S295L和mpr F L826F在细菌对达托霉素耐药中的作用,但mpr F L341F、cls2 F60S和cls2 F60L的作用还未证实。本研究中,在Newman野生菌株中构建的mpr F L341F位点突变使其达托霉素的MIC值从0.25μg/m L升高到4μg/m L,回复该突变位点后达托霉素MIC值恢复到0.25μg/m L。表明mpr F L341F位点的突变可以直接改变Newman对达托霉素的敏感性。sae R基因的缺失不能改变细菌对达托霉素的敏感性但可以增强细菌在达托霉素环境下的竞争能力。研究结论1.达托霉素对于我国的MRSA分离株具有良好的体外抗菌效果。2.金黄色葡萄球菌对达托霉素耐药后生长速度减慢、致病能力减弱。金黄色葡萄球菌对达托霉素的耐药可能与细菌细胞壁增厚、细菌表面正电荷增加、生物膜形成能力增加、初始膜电位降低等有关。3.mpr F基因L341F位点的突变可以直接降低金黄色葡萄球菌Newman对达托霉素的敏感性。