论文部分内容阅读
炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一种慢性胃肠道炎症性疾病。目前认为,遗传易感性、肠道菌群失调和异常的免疫应答都与IBD的发生和发展有关。而肠上皮屏障作为调节三者平衡的中心环节,维持其完整性对IBD的治疗尤为重要。肠上皮屏障的破坏导致“漏肠”发生,肠腔细菌进入固有层,引起异常免疫应答,诱发溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）。同时,免疫细胞分泌的炎症因子（如TNF-α、IFN-γ和IL-13等）反作用于肠上皮细胞,增大肠上皮通透性,进一步引发炎症级联反应,导致IBD的迁延难愈。肠上皮通透性作为衡量上皮屏障的关键指标,主要是受跨上皮途径和细胞旁途径构成,二者均与细胞间紧密连接（Tight junction,TJ）密切相关。肌球蛋白轻链激酶（Myosin light chain kinase,MLCK）途径作为调控TJ的关键途径之一,其通路的活化促使细胞骨架肌动蛋白纤丝滑动,导致与TJ紧密相连的肌球蛋白环收缩,向心力增强,出现TJ松弛而形成细胞间隙,造成肠上皮通透性增加。目前研究对于恢复肠上皮屏障保护机制尚无明确有效的方法。汉黄芩苷作为黄芩汤的主要活性成分,前期研究发现其在结肠分布中最高,对UC小鼠具有明显的治疗作用。且有文献报道,汉黄芩苷是通过抑制NLRP3和NF-κB通路起到治疗溃疡性结肠炎的作用,但对其屏障的保护作用及其机制尚未报道。基于此,同时鉴于屏障功能在治疗UC中的重要作用,本课题采用葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）诱导UC小鼠模型和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）刺激的单层Caco-2细胞损伤模型,初步探讨汉黄芩苷对肠上皮屏障的保护作用及其作用机制。目的:本课题通过汉黄芩苷对UC小鼠溃疡部分的修复作用及降低其肠道通透性的作用,证明汉黄芩苷对UC小鼠肠上皮屏障的保护作用;同时采用荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）,评价汉黄芩苷对肠黏膜细菌浸润的影响。结合体外细胞实验,观察汉黄芩苷对紧密连接蛋白的调控作用,并探究其对MLCK/pMLC2信号通路的作用机制。方法:1.汉黄芩苷对UC小鼠的药效学研究采用DSS 口服法诱导C57BL/6小鼠建立UC模型。将C57BL/6小鼠随机分为6组,分别是正常组、3%DSS组、汉黄芩苷低（12.5 mg/kg）、中（25 mg/kg）、高剂量（50 mg/kg）组和柳氮磺吡啶（500mg/kg）组。给予模型组和给药组自由饮用3%DSS 6天,并按组别同时灌胃无菌蒸馏水或相应药物。每天记录小鼠体重、饮水量、进食量以及粪便形态。为综合评价药物的整体疗效,本研究检测各组小鼠血清中白细胞比例、计算脾脏指数和胸腺指数、统计结肠长度以及病理组织学评分。2.汉黄芩苷对肠上皮屏障的保护作用2.1汉黄芩苷对UC小鼠的肠上皮通透性和结肠细菌侵袭的影响第11天,在禁食12小时后给小鼠按体重灌胃剂量为20mg/kg的FITC-葡聚糖（FD4）,并于4小时后收集小鼠血清评估肠上皮通透性。采用荧光原位杂交技术检测各组结肠细菌侵袭情况。2.2汉黄芩苷对TNF-α诱导的单层Caco-2细胞损伤模型的保护作用通过检测跨上皮电阻（Transepithelial resistance,TER）变化情况筛选出TNF-α的造模浓度和造模时间,同时利用细胞动态成像仪观察汉黄芩苷对Caco-2细胞增殖的影响。通过电阻仪检测TER和多功能荧光酶标仪检测FD4通过率。2.3汉黄芩苷对UC小鼠结肠和单层Caco-2细胞损伤模型紧密连接蛋白的影响蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测结肠和Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin1表达的变化,并通过免疫荧光（Immunofluorescence,IF）进一步进行印证。2.4汉黄芩苷对UC小鼠结肠组织肠上皮细胞紧密连接形态的影响利用H&E染色观察汉黄芩苷对UC小鼠溃疡部分的修复作用,同时采用透射电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察结肠紧密连接的超微结构。3.汉黄芩苷通过抑制MLCK/pMLC2信号通路修复肠上皮屏障的机制研究采用ELISA法测定UC小鼠血清中细胞因子的表达水平;免疫荧光检测汉黄芩苷对Caco-2细胞的F-actin表达以及定位变化的影响;WB检测汉黄芩苷对Caco-2细胞和结肠组织中MLCK、pMLC2和MLC2蛋白表达的影响。结果:1.汉黄芩苷对UC小鼠的治疗作用给予3%DSS处理的UC小鼠体重明显减轻,出现少动蜷缩,腹泻和便血等症状,结肠长度显著缩短,汉黄芩苷各剂量组和阳性药柳氮磺胺吡啶（Sulfasalazine,SASP）均能不同程度地缓解以上症状,尤以汉黄芩苷中、高剂量和SASP明显（P<0.01）。此外,汉黄芩苷和SASP可减少UC小鼠外周血中白细胞的数量（P<0.05）。病理评分结果显示,模型组小鼠结肠组织肌层增厚,黏膜层溃烂,许多杯状细胞和结肠腺体消失,并被浸润性炎症细胞取代（P<0.001）。给予汉黄芩苷或SASP干预后,UC小鼠的组织病理学评分明显降低,且中、高剂量组和SASP组接近恢复正常水平（P<0.05或P<0.001）。同时,本课题评估了 UC小鼠中脾脏和胸腺指数,其可间接反映小鼠的炎症水平。实验结果显示,汉黄芩苷高剂量对二者均有改善作用（P<0.05或P<0.001）,SASP对胸腺指数也有显著的恢复作用（P<0.001）。2.汉黄芩苷对UC小鼠肠道通透性的影响结果表明,汉黄芩苷可以剂量依赖的方式降低UC小鼠血液中的FD4通过率（P<0.05或P<0.01）。同时,本研究发现模型组的小鼠结肠黏膜细菌浸润比正常组更严重,并且在给予汉黄芩苷或SASP后明显减少。3.汉黄芩苷对UC小鼠TJ蛋白表达的影响与正常组相比,模型组小鼠TJ蛋白的表达明显下调（P<0.05或P<0.001）,给药干预后,均有不同程度的恢复,尤其是汉黄芩苷中、高剂量组和SASP组,具有显著统计学意义（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。与WB结果一致,免疫荧光结果显示模型组小鼠结肠中ZO-1和Occludin的表达降低,并且在汉黄芩苷或SASP处理后得以恢复。ELISA结果显示,汉黄芩苷可以下调UC小鼠血清中的细胞因子IL-13和IFN-γ（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。H&E染色结果显示,不同剂量的汉黄芩苷和SASP可以恢复由3%DSS引起的肠上皮细胞脱落。此外,透射电镜结果表明,汉黄芩苷可恢复UC小鼠结肠的TJ。4.汉黄芩苷对TNF-α诱导的单层Caco-2细胞损伤模型TER和FD4通过率的影响给予25、50和75 ng/mL TNF-α分别刺激24、48和72h后,单层屏障被破坏,TER显著下降（P<0.01或P<0.001）。细胞毒性实验表明,刺激24小时后25、50和75ng/mLTNF-α和汉黄芩苷低、中、高剂量组对Caco-2细胞均无毒性。故本课题使用接近文献报道剂量的25 ng/mL作为TNF-α的刺激浓度。汉黄芩苷或MLCK抑制剂Peptide 18能够显著抑制TNF-α诱导单层Caco-2细胞损伤模型的TER水平降低（P<0.05或P<0.01）。与TER分析的结果一致,TNF-α增加FD4的细胞旁路通过率。给予汉黄芩苷和Peptide 18干预后,FD4通过率明显下降（P<0.05或P<0.01）。5.汉黄芩苷对Caco-2细胞骨架蛋白F-actin和TJ蛋白的影响在用TNF-α刺激后,ZO-1,Occludin和Claudinl蛋白水平显著降低（P<0.05或P<0.01）,并且在用汉黄芩苷和Peptide 18干预后其表达明显恢复,表明汉黄芩苷和MLCK抑制剂减弱了由TNF-α引起的TJ屏障完整性损伤（P<0.05或P<0.01）。本课题证明TNF-α诱导了 Caco-2细胞中ZO-1和Occludin分布的变化,并且一些部分几乎是不连续的。而汉黄芩苷和MLCK抑制剂干预后可缓解TNF-α诱导的ZO-1和Occludin分布的变化,同时抑制TNF-α诱导F-肌动蛋白的崩解,恢复细胞的正常形态。6.汉黄芩苷对UC小鼠和Caco-2细胞MLCK/pMLC2信号通路的影响MLC2磷酸化可以影响F-肌动蛋白的变化,并且MLC2磷酸化受MLCK调控。结果表明,汉黄芩苷可抑制TNF-α诱导的MLCK活化,从而抑制MLC2的磷酸化（P<0.05或P<0.01）。与体内结果一致,体外研究发现,汉黄芩苷中、高剂量组与MLCK抑制剂Peptide18起到对MLCK/pMLC2信号通路相同的抑制作用。结论:1.汉黄芩苷可以修复溃疡性结肠炎小鼠受损的肠上皮屏障,并改善疾病;2.汉黄芩苷修复受损的肠上皮屏障的同时可保护肠上皮紧密连接,其机制可能与调控MLCK/pMLC2信号通路有关。