植物细胞内合成的ATP可以作为“能量货币”,为植物的生长发育提供能量,同时在一定条件下ATP也可以释放到细胞外。细胞外ATP(extracellular ATP,eATP)可以作为信号分子,参与调控植物的生长发育及环境适应性,eATP的生理功能和作用机制正成为植物发育与抗逆生理研究的一个新的重要内容。本实验室前期工作发现eATP对于拟南芥幼苗主根生长方向有影响,主根生长受到高浓度ATP抑制,且表现出明显的ATP躲避性反应(eATP avoidance response),显示根系视高浓度ATP为一种伤害性刺激。为阐明拟南芥根系应对eATP刺激、调整生长发育的信号转导机制,本文完成了两项主要工作:1.异三聚体G蛋白在拟南芥幼苗主根eATP躲避反应中的作用本实验室前期实验表明,拟南芥幼苗主根可以感受到eATP,并使根的生长方向发生改变,表现出明显的eATP负趋向性生长,我们将其定义为ATP躲避性生长方式。为进一步探究拟南芥幼苗主根在eATP躲避生长过程中的信号转导机制,我们分别观察了异三聚体G蛋白α、β、γ亚基(Gα、Gβ、Gγ)功能缺失突变体幼苗在含有ATP的接合培养基中的生长状况。实验结果表明,在Gα功能缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)中,幼苗主根对eATP的躲避生长反应明显减弱。Gβ功能缺失突变体(agb1-1、agb1-2)和Gγ功能缺失突变体(agg1-1、agg1-2)幼苗主根会对eATP产生躲避生长的反应,与野生型没有明显差异。结果显示,拟南芥幼苗主根感受eATP,并发生躲避生长反应的过程中,Gα发挥着至关重要的作用。为进一步探究Gα参与eATP调控拟南芥主根躲避生长反应的作用机制,我们利用杂交的方法将DR5-GFP和DⅡ-VENUS融合基因转化到野生型(WS)和Gα缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)中,利用激光共聚焦显微镜观察eATP处理后的拟南芥幼苗主根细胞中生长素含量及分布的变化。结果显示,ATP处理24h后,野生型幼苗在根尖细胞,尤其是静止中心及周围细胞中DR5-GFP的含量明显增加;同时DR5-GFP发生不对称分布,在主根弯曲点内侧细胞中的含量明显高于外侧细胞。对含有DⅡ-VENUS的野生型进行ATP处理24h后发现,野生型幼苗在根尖细胞,尤其是静止中心及周围细胞中DⅡ-VENUS的含量降低;同时DⅡ-VENUS发生不对称分布,在主根弯曲点内侧细胞中的含量明显低于外侧细胞。以上结果说明,野生型幼苗根尖细胞中生长素含量增加,生长素的积累会使主根伸长生长受抑制,导致幼苗主根伸长速率减缓;野生型幼苗主根在弯曲点内侧细胞中生长素含量高于外侧细胞,说明拟南芥幼苗主根对生长素敏感,在生长素积累的一侧,细胞生长受抑制,进而产生躲避性生长。ATP处理后,在Gα缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)幼苗根尖细胞中DR5-GFP含量增加,但未出现明显的分布变化;在带有DⅡ-VENUS标记的突变体幼苗中,根尖细胞中的DⅡ-VENUS含量降低,但是并未出现明显的分布变化。以上结果说明eATP诱使Gα缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)根尖细胞中生长素含量增加,生长素积累会使主根伸长生长受抑制导致幼苗主根伸长速率减缓;但是Gα突变体主根生长素未见明显的不均匀分布,也没有发生eATP躲避性生长反应。综上所述,Gα通过影响生长素的不对称分布,调控拟南芥幼苗主根对eATP的躲避反应。为进一步探究Gα如何影响生长素的不对称分布来调控幼苗主根对eATP躲避性生长反应,我们利用杂交的方法将PIN1-GFP、PIN2-GFP、PIN3-GFP、PIN7-GFP和AUX1-YFP融合基因转化到野生型(WS)和Gα缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)中,利用激光共聚焦显微镜观察eATP处理后的拟南芥幼苗主根细胞中生长素运输蛋白含量及分布的变化。结果显示,野生型幼苗经ATP处理后,幼苗根尖中柱和内皮层细胞中PIN1-GFP的含量降低,但未见明显的不对称分布现象;根尖中柱和小柱细胞中PIN3-GFP的含量降低,但未见明显的不对称分布现象;PIN7-GFP在根尖细胞中含量降低,但未见明显的不对称分布现象;位于幼苗根尖中柱、小柱和表皮细胞中的AUX1-YFP含量降低,但未见明显的不对称分布现象;位于根尖表皮和皮层细胞中PIN2-GFP的含量降低,并且发生了明显的不对称分布现象,在主根弯曲点内侧细胞中PIN2-GFP含量明显高于外侧细胞。说明拟南芥幼苗在ATP处理后,PIN1、PIN2、PIN3、PIN7和AUX1在根尖细胞中含量均有明显降低,影响了生长素运输总和的含量,导致幼苗主根伸长速率减缓;而PIN2-GFP在根尖细胞中的不对称分布,与生长素DR5-GFP的不对称分布相同,都是在主根弯曲点内侧细胞中含量明显高于外侧细胞,我们推测PIN2的不对称分布可能使得生长素运输不均衡,从而导致生长素的不对称分布,引起幼苗主根ATP躲避性生长反应。在Gα缺失突变体(gpα1-1、gpα1-2)幼苗根尖细胞中PIN1-GFP、PIN3-GFP、PIN7-GFP和AUX1-YFP含量降低,且均未出现明显的分布变化,说明Gα未参与eATP影响PIN1、PIN3、PIN7和AUX1的表达及定位。而在两个Gα缺失突变体中PIN2含量降低,但是分布未见明显变化,显示Gα缺失阻抑了 eATP调节PIN2不对称分布的现象,说明Gα通过影响生长素转运蛋白PIN2的不对称分布,引起生长素的不对称分布,进而调控拟南芥幼苗主根对eATP的躲避反应。为进一步阐明Gα在拟南芥幼苗主根eATP躲避反应中的作用,我们利用基因芯片、高通量测序和荧光定量PCR等方法分析检测了野生型与突变体在eATP处理前后根尖细胞中基因的表达模式。结果表明,ATP处理60 min后,野生型中有650个基因表达发生了上调,765个基因表达发生下调,Gα突变体(gpα1-2)中有622个基因表达量上调,702个基因表达量下调。通过荧光定量PCR的验证发现,一些在野生型中表达显著上调的基因在Gα突变体中表达未发生明显上调,说明Gα可能参与了受ATP调控的功能基因的表达。对这些基因功能分析表明,这些基因与生长素代谢或生长素反应有关。为进一步探究这些功能基因在eATP躲避生长反应中的作用,我们观察了WAG1、WAG2等基因的突变体幼苗在接合培养基中的生长情况。结果表明,在WAG1功能缺失突变体wag1-1、wag1-2、wag1-3、wag1-5中,幼苗主根对eATP的躲避生长反应明显增强。WAG2功能缺失突变体wag2-1、wag2-2中,幼苗主根对eATP的躲避生长反应略有增强。说明在拟南芥幼苗主根躲避eATP生长的反应中,WAG1和WAG2均发挥了不同程度的作用。基于以上结果,我们推测拟南芥幼苗主根在eATP躲避性生长过程的信号转导途径可能为“eATP→异三聚体G蛋白α亚基→生长素运输蛋白PIN2→生长素不对称分布→主根弯曲生长”。2.乙烯反应因子ERFx在eATP调控拟南芥幼苗生长素含量和运输过程中的作用实验室前期实验表明,乙烯响应因子ERFx在eATP调控拟南芥幼苗生长过程中发挥重要作用。在光照条件下,eATP抑制拟南芥野生型幼苗主根的伸长生长;而在ERFx的缺失突变体erfx中,幼苗主根不响应ATP,主根伸长生长不受明显抑制。在黑暗条件下,eATP使拟南芥野生型黄化苗发生“三重反应”,但在erfx中,下胚轴响应eATP刺激发生弯曲生长的反应明显减弱。为探究ERFx在eATP调控拟南芥幼苗主根及下胚轴生长发育过程中所发挥的作用,我们利用杂交的方法将DR5-GFP融合基因转化到野生型(Col-0)和ERFx缺失突变体(erfx)中,利用激光共聚焦显微镜观察eATP处理后的拟南芥幼苗主根细胞中生长素的含量及分布的变化。结果显示,ATP处理24h后,野生型幼苗根尖细胞,尤其是静止中心及周围细胞中DR5-GFP的含量明显增加,说明野生型幼苗在根尖细胞中生长素含量增加,生长素的积累会使主根伸长生长受抑制,导致幼苗主根伸长速率减缓。在ERFx缺失突变体(erfx)幼苗根尖细胞中DR5-GFP含量未见明显增加,说明在eATP诱导下,ERFx缺失突变体(erfx)根尖细胞中生长素含量没有积累,不会使主根伸长生长受明显抑制,幼苗主根伸长速率不变。以上结果表明,拟南芥幼苗主根的生长素代谢与ERFx有关。为进一步探究ERFx在eATP调节生长素含量和分布变化过程中的作用,我们利用杂交的方法将 PIN1-GFP、PIN2-GFP、PIN3-GFP、PIN7-GFP 和 AUX1-YFP融合基因转化到野生型(Col-0)和ERFx缺失突变体(erfx)中,利用激光共聚焦显微镜观察eATP处理后的拟南芥幼苗主根细胞中生长素运输蛋白含量和分布的变化。结果显示,ATP处理后,野生型(Col-0)和ERFx缺失突变体(erfx)中PIN1-GFP、PIN2-GFP、PIN3-GFP和AUX1-YFP的亮度和分布范围没有明显差异;野生型和突变体中柱细胞中PIN7-GFP的亮度差异不明显,但是突变体小柱细胞中的PIN7-GFP亮度明显高于野生型。说明ATP调控拟南芥幼苗主根伸长生长的过程中,ERFx可能参与了对生长素运输载体PIN7的调控过程。黑暗条件下生长的野生型黄化苗下胚轴细胞中DR5-GFP含量在eATP刺激后显著提高,且弯曲点外侧细胞中DR5-GFP含量明显高于内侧,表明生长素刺激下胚轴细胞的生长,生长素多的一侧细胞生长迅速。黄化苗下胚轴中生长素运输载体蛋白的表达也受到eATP的影响。ATP处理后,野生型黄化苗下胚轴细胞中PIN3-GFP表现出明显的不对称分布,弯曲点外侧细胞中PIN3-GFP含量明显高于内侧,但erfx突变体中并未发现DR5-GFP和PIN3-GFP的不对称分布现象。下胚轴细胞中PIN1、PIN2、PIN7和AUX1在ATP处理后的表达与分布均未出现明显变化,说明ATP诱使黄化苗下胚轴弯曲生长过程中ERFx可能参与了对生长素运输载体PIN3的调控过程。综上所述,我们推测拟南芥幼苗主根伸长生长过程的信号转导机制可能为“eATP→乙烯响应因子ERFx→生长素运输载体PIN7→生长素含量增加→主根伸长生长抑制”。而在eATP引起拟南芥黄化苗下胚轴弯曲生长过程中其信号转导机制可能是“eATP→乙烯响应因子ERFx→生长素运输载体PIN3→生长素不对称分布→下胚轴弯曲生长”。