心血管疾病已成为21世纪威胁人类健康的主要疾病之一,其中最为凶险的是急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndrome,ACS),ACS包括不稳定心绞痛和急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)。全球每年有近1700万人死于心血管疾病,其中一半以上死于急性心肌梗死。急性心肌梗死起病突然,急性期死亡率约为30%。对于AMI的诊断,心电图的观察是常用的检测手段,但对于那些心电图正常的AMI患者,其作用就变得十分有限。因此,选择特异性的窗口期短的生化指标来诊断AMI变得尤为必要。人心脏型脂肪酸结合蛋白(hunan heart-type fatty acid binding protein,HFABP)是灵敏度和特异性都很高的心肌损伤标志物,可以作为AMI早期诊断、风险评估和预后判断的一种很好的生化指标。在AMI早期诊断中,比传统诊断标志物cTnI/T,CK-MB更灵敏、更准确。本研究从人心脏组织中提取总RNA,利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA,以 cDNA为模板,PCR扩增HFABP编码序列,然后采用原核表达系统表达重组HFABP。质谱鉴定重组蛋白为HFABP,其蛋白相对分子质量为 14906Da,与天然HFABP的相对分子质量大小符合。重组HFABP与进口抗HFABP单克隆抗体发生良好的免疫反应,且具有形成二聚体和寡聚体的能力,说明其可能模拟了天然HFABP的构象,可作为制备单克隆抗体的免疫抗原。经硫酸铵沉淀、His-taq柱和分子筛层析柱纯化后,重组蛋白的纯度可以达到99%以上。以纯化后的HFABP为免疫抗原,采用皮下多点注射免疫4-6周龄的BALB/c雌性小白鼠,抗原剂量为每只小鼠每次100μg,利用间接ELISA检测免疫小鼠血清效价。结果显示,随着免疫次数的增加,小鼠血清抗体量呈梯度上升趋势,第4次免疫后血清效价百万倍稀释后为阳性。融合前采用脾脏免疫和尾静脉注射加强免疫,小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合后,利用20%FBS-HAT-1640培养基筛选融合细胞。阳性克隆经过4次克隆化后,筛选到9株能高效、稳定分泌抗HFABP单克隆抗体的细胞株,并对其抗体类型和亚型进行了鉴定。Western blotting和间接ELISA结果显示,9株单抗与重组HFABP均具有良好的免疫反应性。采用缺失突变的方法,在大肠杆菌中表达了一系列C-端氨基酸缺失HFABP突变体蛋白,以纯化或纯化复性的重组蛋白作为抗原,采用间接ELISA和Western blotting初步确定了筛选抗体是线性型还是构象型抗体,并确定了抗体相应的抗原识别表位。本研究在大肠杆菌中表达出具有高活性的重组HFABP蛋白,并筛选制备了针对不同抗原表位的高活性和高灵敏度的单克隆抗体,既得到了线性单抗,又得到了构象型单抗,为今后开发具有自主知识产权的HFABP诊断试剂奠定了基础。