【摘 要】
:
目的:基于两种肾透明细胞癌细胞系研究LncRNAAFAP1-AS1高表达在肾癌对舒尼替尼耐药中发挥作用的分子机制。方法:通过慢病毒载体包装构建AFAP1-AS1稳定高表达的769-P和786-O肾透明细胞癌细胞系。我们使用CCK-8实验进行验证上调AFAP1-AS1后的实验组细胞对于舒尼替尼的耐药性变化;使用Transwell实验检测上调AFAP1-AS1的实验组细胞相对于对照组细胞侵袭性的变化;
论文部分内容阅读
目的:基于两种肾透明细胞癌细胞系研究LncRNAAFAP1-AS1高表达在肾癌对舒尼替尼耐药中发挥作用的分子机制。方法:通过慢病毒载体包装构建AFAP1-AS1稳定高表达的769-P和786-O肾透明细胞癌细胞系。我们使用CCK-8实验进行验证上调AFAP1-AS1后的实验组细胞对于舒尼替尼的耐药性变化;使用Transwell实验检测上调AFAP1-AS1的实验组细胞相对于对照组细胞侵袭性的变化;通过流式细胞术实验分析比较两组细胞的凋亡能力差异;最后通过Western Blotting实验检测PTEN-AKT-mTOR通路蛋白、凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bcl-2等)、LC3A/B、BECN1等自噬相关蛋白、HTRA3、AFAP1等编码蛋白的表达水平;以期寻找LncRNAAFAP1-AS1高表达的肾癌细胞系与对照组细胞系中在生物学过程中存在的不同,对LncRNAAFAP1-AS1在肾细胞癌对舒尼替尼耐药中的机制进行初步探索。结果:在本次研究中,我们通过CRISPR/dCas9技术,在MPH、dCas9元件的介导下,成功将目的基因AFAP1-AS1在786-O及769-P肾癌细胞系中过表达,并获得用于实验的单克隆细胞,通过RT-q PCR检测证明了实验组各单克隆细胞中AFAP1-AS1的表达与相应的对照组细胞相比显著上调。然后我们进行了CCK-8实验观察对照组和实验组对舒尼替尼的耐受性,结果显示AFAP1-AS1上调的实验组细胞耐药性更强,证明我们成功构建耐舒尼替尼,且在该耐药细胞系中AFAP1-AS1显著过表达。然后我们进行的蛋白印迹实验结果证明过表达AFAP1-AS1可通过激活PTEN/AKT/mTOR信号通路参与耐药过程。另外,Transwell实验结果显示AFAP1-AS1过表达时肾癌769-P和786-O细胞均具有更强的侵袭性。在流式细胞术实验中我们得到耐药单克隆细胞的早期凋亡比例低于对照组细胞,另外在Western Blotting中的结果也显示AFAP1-AS1高表达的实验组细胞Caspase-3总蛋白对照组细胞有显著降低,Caspase-9蛋白表达亦有明显下降,而Bcl-2作为凋亡的抑制因素,其在实验组细胞中的表达一定程度升高,综上证明,过表达AFAP-AS1的细胞的凋亡进程被抑制;然后我们利用蛋白印迹实验对细胞保护性自噬过程进行了检测,结果显示两组实验组细胞中LC3A/B及BECN1蛋白表达均较对照组明显升高。总结后我们认为AFAP1-AS1可以通过PTEN/AKT/mTOR通路介导下抑制耐药细胞的凋亡过程,并促进保护性自噬的发生。最后我们通过UCSC数据库寻找了AFAP1-AS1上下游1MB的编码基因,发现了HTRA3及AFAP1,并通过Western Blotting实验得到实验组细胞HTRA3的蛋白表达量更高,提示HTRA3可能在肾细胞癌对舒尼替尼耐药的形成过程中具有重要作用。结论:AFAP1-AS1过表达可通过激活PTEN/AKT/mTOR信号通路参与肾透明细胞癌耐舒尼替尼的发生;该通路的激活导致肾癌细胞的凋亡过程被抑制,保护性自噬过程被激活。另外编码蛋白HTRA3的表达升高提示CIS机制可能也参与了耐药过程的形成,即凋亡的抑制与自噬的激活可能与HTRA3的上调密切相关。AFAP1-AS1未来或许可以成为预测肾透明细胞癌进行舒尼替尼靶向治疗后疗效及预后的重要靶点。
其他文献
目的:观察稳定期慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)患者肠道菌群失调的相关因素并构建和验证预警模型,确定该预警模型预测肠道菌群失调风险分层的最佳临界值,以评估稳定期COPD患者肠道菌群失调的风险概率。方法:2019年1月1日至2020年12月31日,在江苏大学附属宜兴医院呼吸与危重症医学科门诊就诊的稳定期COPD患者作为开发队列被
习近平生态文明思想可追溯自中华文明和马克思主义的人与自然观,历经“建党—新中国成立—改革开放—新时代”百年积淀,其对毛泽东思想、邓小平理论、“三个代表”重要思想、科学发展观的传承与发展,很好地实现了党和国家大政方针与习近平“正定—福建—浙沪”地方实践的协同“共振”,在“问题+目标”导向和“制度+规划”路径下,实现了在生态文明思想、理论、制度与实践上自觉性、能动性和有效性的有机统一,根据不同历史时期
目的探讨含卵巢肿瘤蛋白酶域6B(OTU domain-containing 6B,OTUD6B)对糖尿病斑块内血管新生的影响。方法(1)动物实验:按照每只Apo E-/-小鼠链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)40mg/kg/day的标准进行腹腔注射处理,连续5天。选取2周后血糖水平高于300mg/d L的小鼠纳入分组,并通过喂养高脂饲料16周来构建体内糖尿病动脉粥样硬化模型。将上述
研究目的:放疗(Radiotherapy,RT)诱导肿瘤细胞铁死亡是治疗难治性肿瘤的新策略。然而,肿瘤细胞的固有抗性大大削弱了放疗诱导肿瘤细胞铁死亡的效果。本研究旨在评估二甲双胍(Metformin,M)对放疗诱导胰腺癌细胞铁死亡的协同作用并深入探究其中的机制。研究方法:克隆形成实验、流式细胞术、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)检测、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)检测,
第一部分不同的感兴趣区设置方法对测量肾透明细胞癌增强CT值的影响及可重复性比较目的:探讨不同的感兴趣区(region of interest,ROI)设置方法对肾透明细胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma,cc RCC)各期增强CT值测量的影响及可重复性比较。方法:收集2020年1月至2021年10月在本院就诊,经病理证实为cc RCC的患者,符合要求并纳入本研究的
目的:构建人ADAM33解整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase33,ADAM33)基因启动子并鉴定其核心启动子区域;探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)过表达及敲低对ADAM33基因启动子活性的影响;探索转录因子GATA3与ADAM33启动子区域在体内是否可以结合;探讨过表达及敲低GAT
现有普通干线公路桥梁与隧道普遍存在建设年代久远、设计标准低、耐久性不足的情况,如何合理分配有限的养护资金至关重要。从养护管理决策的影响因素入手,分析了传统桥隧养护管理决策方法存在的问题,提出桥隧养护管理科学决策新思路,对管理手段进行改进,使养护管理决策更为科学,实现养护资金的合理分配。
目的:对于大面积皮肤缺损的患者,皮肤移植是临床中常见的解决方案。然而由于可供移植的皮肤来源有限,远不能满足临床需求,因此迫切需要有效的替代方案。通过组织工程构建的三维皮肤替代物具有良好的耐受性、来源充足的特点,有望成为皮肤移植物的有效替代品。然而,血管化不足是限制其临床应用的主要原因之一,缺乏血管化的三维皮肤替代物由于无法及时有效的与宿主整合,极有可能导致其坏死。本研究拟通过从人体皮肤和脐带组织中
研究目的:难治性间质型肿瘤细胞对铁死亡诱导剂敏感。然而,其调控机制仍不明确。糖脂代谢是间质型肿瘤细胞治疗抵抗的关键因素,本研究旨在探讨糖脂代谢在间质型肿瘤细胞铁死亡中的作用及其潜在机制。研究方法:(1)CCK-8试剂盒验证不同培养条件下Erastin和RSL3对人胰腺癌细胞(PANC1,PaTU8988)活性的作用;丙二醛法(MDA)检测葡萄糖浓度梯度降低处理条件下Erastin处理后PaTU89
目的:1、基于数字乳腺断层摄影(digital breast tomosynthesis,DBT)检查中的不同方位视图分别构建五种机器学习分类模型,评估基于DBT图像的影像组学技术在术前评估浸润性乳腺癌脉管侵犯(Lymphovascular invasion,LVI)方面的价值。2、联合由影像组学预测模型计算出的影像组学评分(Radiomics Score,Rad-score)和DBT图像语义特征