【摘 要】
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目的:基于两种肾透明细胞癌细胞系研究LncRNAAFAP1-AS1高表达在肾癌对舒尼替尼耐药中发挥作用的分子机制。方法:通过慢病毒载体包装构建AFAP1-AS1稳定高表达的769-P和786-O肾透明细胞癌细胞系。我们使用CCK-8实验进行验证上调AFAP1-AS1后的实验组细胞对于舒尼替尼的耐药性变化;使用Transwell实验检测上调AFAP1-AS1的实验组细胞相对于对照组细胞侵袭性的变化;
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目的:基于两种肾透明细胞癌细胞系研究LncRNAAFAP1-AS1高表达在肾癌对舒尼替尼耐药中发挥作用的分子机制。方法:通过慢病毒载体包装构建AFAP1-AS1稳定高表达的769-P和786-O肾透明细胞癌细胞系。我们使用CCK-8实验进行验证上调AFAP1-AS1后的实验组细胞对于舒尼替尼的耐药性变化;使用Transwell实验检测上调AFAP1-AS1的实验组细胞相对于对照组细胞侵袭性的变化;通过流式细胞术实验分析比较两组细胞的凋亡能力差异;最后通过Western Blotting实验检测PTEN-AKT-mTOR通路蛋白、凋亡相关蛋白（Caspase-3、Bcl-2等）、LC3A/B、BECN1等自噬相关蛋白、HTRA3、AFAP1等编码蛋白的表达水平;以期寻找LncRNAAFAP1-AS1高表达的肾癌细胞系与对照组细胞系中在生物学过程中存在的不同,对LncRNAAFAP1-AS1在肾细胞癌对舒尼替尼耐药中的机制进行初步探索。结果:在本次研究中,我们通过CRISPR/dCas9技术,在MPH、dCas9元件的介导下,成功将目的基因AFAP1-AS1在786-O及769-P肾癌细胞系中过表达,并获得用于实验的单克隆细胞,通过RT-q PCR检测证明了实验组各单克隆细胞中AFAP1-AS1的表达与相应的对照组细胞相比显著上调。然后我们进行了CCK-8实验观察对照组和实验组对舒尼替尼的耐受性,结果显示AFAP1-AS1上调的实验组细胞耐药性更强,证明我们成功构建耐舒尼替尼,且在该耐药细胞系中AFAP1-AS1显著过表达。然后我们进行的蛋白印迹实验结果证明过表达AFAP1-AS1可通过激活PTEN/AKT/mTOR信号通路参与耐药过程。另外,Transwell实验结果显示AFAP1-AS1过表达时肾癌769-P和786-O细胞均具有更强的侵袭性。在流式细胞术实验中我们得到耐药单克隆细胞的早期凋亡比例低于对照组细胞,另外在Western Blotting中的结果也显示AFAP1-AS1高表达的实验组细胞Caspase-3总蛋白对照组细胞有显著降低,Caspase-9蛋白表达亦有明显下降,而Bcl-2作为凋亡的抑制因素,其在实验组细胞中的表达一定程度升高,综上证明,过表达AFAP-AS1的细胞的凋亡进程被抑制;然后我们利用蛋白印迹实验对细胞保护性自噬过程进行了检测,结果显示两组实验组细胞中LC3A/B及BECN1蛋白表达均较对照组明显升高。总结后我们认为AFAP1-AS1可以通过PTEN/AKT/mTOR通路介导下抑制耐药细胞的凋亡过程,并促进保护性自噬的发生。最后我们通过UCSC数据库寻找了AFAP1-AS1上下游1MB的编码基因,发现了HTRA3及AFAP1,并通过Western Blotting实验得到实验组细胞HTRA3的蛋白表达量更高,提示HTRA3可能在肾细胞癌对舒尼替尼耐药的形成过程中具有重要作用。结论:AFAP1-AS1过表达可通过激活PTEN/AKT/mTOR信号通路参与肾透明细胞癌耐舒尼替尼的发生;该通路的激活导致肾癌细胞的凋亡过程被抑制,保护性自噬过程被激活。另外编码蛋白HTRA3的表达升高提示CIS机制可能也参与了耐药过程的形成,即凋亡的抑制与自噬的激活可能与HTRA3的上调密切相关。AFAP1-AS1未来或许可以成为预测肾透明细胞癌进行舒尼替尼靶向治疗后疗效及预后的重要靶点。
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