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第一部分 SEMA3A基因新发变异的识别及致病性研究背景:先天性低促性腺激素性性腺功能减退症（Congenital hypogonadotropic hypogonadism,CHH）是由于促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone,GnRH）合成、分泌或作用障碍引起的一组以青春期发育延迟或缺失和/或不孕不育为特征的内分泌罕见病。当伴有嗅觉障碍时,被称为卡尔曼综合征（Kallmann syndrome,KS）,约占CHH病例的40%～60%;嗅觉功能正常时,被称为嗅觉正常的CHH（normosmic CHH,nCHH）。CHH发病率低,基因型-表型关系复杂,部分病例难以通过简单的临床表现给出明确诊断,“小阴茎、小睾丸、不育”等生殖系统的缺陷给患者和家庭带来了沉重的心理负担。因此,基因检测在早期诊断和鉴别诊断CHH方面发挥着越来越重要的作用。目前,所有CHH病例中存在遗传缺陷的占50%左右,大约有50余种基因突变可导致CHH。其中约20余种可导致KS,包括ANOS1,FGFR1,PROK2,CHD7,SEMA3A等等。在这些基因中,信号素蛋白3A（Semaphorin3A,SEMA3A）是由SEMA3A基因编码的分泌蛋白,主要通过轴突导向,对嗅觉器官的发育和GnRH神经元的迁移至关重要。然而,目前发现的与KS相关的SEMA3A变异仅占KS病例的6%左右,相关的致病分子机制仍不明确,仍需进一步探索。本部分探讨了SEM3A新发变异导致KS的致病性及其相关致病分子机制,为KS患者提供了额外的数据来进行遗传咨询。目的:1.在一个患有KS的家系中识别SEMA3A基因新发变异。2.明确SEMA3A新发突变导致KS的致病性。3.分析SEMA3A导致KS的分子致病机制。方法:1.收集先证者的临床资料。2.收集先证者及家系成员的外周血,提取DNA,利用全外显子测序技术进行相关致病基因的筛查,并通过Sanger测序验证。3.通过Mutation Taster,PolyPhen-2及PROVEAN对SEMA3A新发变异进行生物信息学分析,利用SWISS-MODEL建立了 SEMA3A蛋白同源二聚体模型并利用Deepview将变异累及的区域可视化。4.采用蛋白质印迹（Western blot,WB）和酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）等体外功能实验检测了 SEMA3A突变蛋白的表达量。5.通过PubMed检索,分析SEMA3A导致KS的致病分子机制,并通过人类基因突变数据库（Human gene mutation database,HGMD）对所有报道过的与KS相关的SEMA3A变异进行了归纳总结。结果:1.先证者,男,31岁,存在嗅觉减退和不育的临床表现。化验示性激素水平低;GnRH兴奋试验示LH高峰延迟;精液常规示精子总数少、活力低。超声示双侧睾丸体积小,男性乳腺发育。先证者父亲曾诊断为KS。根据症状、体征、辅助检查和家族史,先证者初步诊断为KS。2.在先证者及其父亲中识别出SEMA3A新发（新生）杂合变异（c.814G＞T,p.D272Y）,国内外尚未见报道,该变异位于有着重要功能并高度保守的Sema结构域。3.生物信息学分析提示它具有高损坏评分的致病意义,蛋白三维结构建模显示突变蛋白的整体空间结构较野生型相对松散,氨基酸性质方面,由原来的带负电荷的酸性状态变成了不带电荷的中性极性状态,即羰基变成了苯环,最终改变了整个蛋白的电荷分布及其稳定性。4.体外功能试验表明,新发变异明显减少了分泌蛋白SEMA3A细胞内和细胞外的表达量（P＜0.05）,证明该变异可以引起SEMA3A蛋白的分泌缺陷。5.致病分子机制分析提示SEMA3A可能通过无法诱导GnRH神经元细胞粘附斑激酶（Focal adhesion kinase,FAK）的磷酸化或影响SEMA3A-NRP-Plexin配体-受体复合物的形成导致疾病的发生。6.通过HGMD数据库,总结归纳出19个与KS相关的SEMA3A致病变异（包括我们新发现的变异）,其中错义突变16个,剪接突变1个,小缺失1个,大缺失1个。68.4%的突变位于Sema结构域,20.8%的患者存在两个与表型相关的致病基因突变。结论:1.我们在患有KS的先证者及其父亲中识别出了 SEMA3A新发变异（c.814G＞T,p.D272Y）。2.生物信息学分析和体外功能实验阐明了 SEMA3A新发变异在KS中的致病性。3.SEMA3A新发变异扩展了SEMA3A的基因突变谱,为KS患者提供了额外的数据来进行遗传咨询,并有助于SEMA3A功能的鉴定及揭示KS的潜在发病机制。第二部分先天性低促性腺激素性性腺功能减退症临床分析背景:先天性低促性腺激素性性腺功能减退症（CHH）是指由于GnRH神经元发育或迁移缺陷,导致垂体促性腺激素分泌不足,进而引起性腺发育障碍的一种罕见病。根据是否合并嗅觉障碍,可分为伴有嗅觉障碍的卡尔曼综合征（KS）和嗅觉正常的CHH（nCHH）。然而,在使用这些术语时要小心,临床常规问诊容易低估患者的嗅觉障碍,如不采取专业的嗅觉评估或影像学检查,KS容易被误诊为nCHH。此外,KS和nCHH之间的界限有时是模糊的,两者的发病可由同一致病基因导致,常见的有FGFR1基因。因此,我们对KS和nCHH的临床表现和激素水平做了详细的差异性分析,为临床医生更好的认识和鉴别两者提供了重要的参考依据。此外,CHH具有明显的临床和遗传异质性,在不同的年龄阶段也具有不同的临床表现,少数CHH患者还合并先天性非生殖表型的发育异常,如唇腭裂、中线缺陷、听力减退、视力障碍、镜像运动等,这对临床医生诊断和鉴别诊断CHH带来了更大的挑战。本部分回顾性分析了 90例男性CHH患者的临床特征,扩大了 CHH的临床表现谱,提高了临床医师对该疾病的认识,有助于临床医生早期诊断、鉴别诊断和治疗CHH。目的:1.收集男性CHH病例,研究分析CHH患者的临床特征。2.比较KS和nCHH患者在就诊年龄、身高、体重、BMI、阴茎长度、睾丸体积、性激素水平等指标间有无统计学差异,为诊断CHH疾病亚型提供了重要的参考依据。方法:1.回顾性分析山东省立医院内分泌科和儿内科2011年10月至2021年1 1月收治的男性CHH患者的临床资料,包括现病史、出生史、家族史、阴茎长度、睾丸体积、性激素水平、GnRH试验、骨龄检测、染色体核型分析和治疗方案等。2.应用SPSS 26.0软件对CHH相关临床数据进行统计学分析。3.通过门诊或电话对CHH患者进行治疗效果的随访。结果:1.本研究共纳入男性CHH患者90例,其中KS患者33例（36.7%）,nCHH患者57例（63.3%）。49例（54.4%）患者超声提示男性乳腺发育。82例CHH患者进行了骨龄检测,其中57例（69.5%）患者显示骨龄落后,平均落后4.1岁。2.KS与nCHH组患者在就诊年龄、身高、体重、BMI、阴茎、睾酮、雌二醇、催乳素等指标之间无统计学差异。但与nCHH组患者相比,KS组患者拥有更严重的生殖表型缺陷,主要表现为促性腺激素水平更低,睾丸更小,隐睾发生率更高（P＜0.05）。3.除了表现为单独的GnRH缺乏相关的生殖表型异常,CHH还可以合并如听力障碍、视力障碍、上睑下垂、中线偏移等非生殖表型异常。4.CHH不同的治疗方案都有其优缺点,不同患者对同一治疗方案的反应也存在较大差异,部分患者可发生CHH逆转。结论:1.CHH除生殖系统的缺陷外,还存在骨龄落后、听力障碍、视力障碍、上睑下垂等非生殖表型的异常。2.KS比nCHH拥有更严重的生殖表型缺陷如“促性腺激素水平更低,睾丸更小,隐睾发生率更高”为临床医生诊断和鉴别诊断KS和nCHH提供了重要的参考依据。3.通过适当的激素替代治疗,CHH患者可以诱导性征的发育,维持正常的性激素水平和健康的性生活,并实现生育。